DNA-analyser i diagnostisk patologi

Lymfomdiagnostikk

PCR-analyser hører med i moderne lymfomdiagnostikk, de er viktige for bestemmelse av klonalitet og for påvisning av spesifikke translokasjoner (6, 7). Lymfomer vil ofte kunne klassifiseres med rutinehistologi og immunhistokjemi, men der det er tvil om en prosess er neoplastisk eller reaktiv, eller der materialet ikke tillater noen sikker morfologisk diagnose, kan polymerasekjedereaksjon være avgjørende for diagnosen. Metoden er gullstandard for påvisning av klonalitet og kan brukes der dette ikke kan bestemmes ved immunhistokjemi eller væskestrømscytometri. I maligne lymfomer er genene for B- og T-cellereseptorer rearrangert slik at det kun dannes én klon (monoklonal populasjon) istedenfor mange forskjellige kloner (polyklonal populasjon) som i normalt lymfoid vev og i reaktivt lymfoid vev. Dermed kan vi også påvise linjetilhørighet, det vil si om et lymfom er av T- eller B-celletype. Flere av non-Hodgkins-lymfomene har spesifikke translokasjoner som fører til rekombinasjoner mellom onkogener og immunglobulingener (tab 1). Dette fører til en deregulering med overproduksjon av normalt onkoprotein. Såfremt de involverte genene er klonet og sekvensert, kan disse spesifikke translokasjonene påvises med polymerasekjedereaksjon og øke den diagnostiske sikkerhet.

Pasient 1. En 69 år gammel mann fikk påvist forstørrede lymfeknuter på halsen og multiple polypper i ventrikkel, duodenum og colon. Histologi viste lavgradig malignt non-Hodgkins-lymfom av B-celletype, sannsynlig mantelcellelymfom. I små tarmbiopsier kan det være vanskelig å skille mantelcellelymfom og MALT-lymfom, som begge er lavgradige maligne non-Hodgkins-lymfomer av B-celletype (fig 2). Det er viktig å stille riktig diagnose fordi klinisk utvikling og prognose er helt forskjellig. MALT-lymfom, som kan forbli lokalisert i flere år, har relativt god prognose. Mantelcellelymfomene som utgjør 5 – 10 % av non-Hodgkins-lymfomene, er mer aggressive og har ofte spredt seg ved diagnosetidspunktet. I 70 % av mantelcellelymfomene sees det en t(11; 14)(q13; q32)-translokasjon som kan påvises med PCR (8). I dette tilfellet fikk man bekreftet diagnosen mantelcellelymfom med PCR-teknikk da den spesifikke t(11;14)-translokasjonen ble påvist i biopsiene fra både tarmpolyppene og lymfeknuten på halsen (fig 3).

Figur 2   Lysmikroskopisk undersøkelse av tarmpolypp fra pasient 1 (HE, 10 ⋅ ). Diffus infiltrasjon av atypiske lymfoide celler i slimhinnen

Figur 3   PCR fra pasient 1 for påvisning av translokasjon mellom kromosom 11 og 14. Det er her benyttet primere mot bruddpunktet, som er lokalisert til kromosom 11, det kalles ”major translocation cluster” (MTC). Opptil 50 % av mantelcellelymfomene har bruddpunktet lokalisert til dette området. Dersom kromosomrearrangeringen har funnet sted, vil det fremkomme et bånd i gelen. Dersom det ikke blir noe PCR-produkt, kan det bety at translokasjonen ikke har funnet sted eller at bruddpunktet er utenfor det området hvor primerne fester seg. Brønn 1: DNA-størrelsesmarkør. Brønn 2: negativ kontroll. Brønn 3: positiv kontroll (mantelcellelymfom). Brønn 4: mantelcellelymfom uten påvist t(11;14). Brønn 5 – 8: Tumorvev fra pasient 2. DNA ble ekstrahert fra polyppene i ventrikkel, duodenum, colon og lymfeknute på halsen

Pasient 2. En åtte år gammel jente fikk påvist forstørrede lymfeknuter på halsen. Hun var symtomfri og virusserologi var negativ da lymfeknutene ble fjernet for histologisk undersøkelse. Det var spørsmål om dette kunne være en reaktiv eller neoplastisk prosess. Histologisk undersøkelse viste forstørrede lymfeknuter, strukturen i områder var utvisket og inntatt av mange atypisk utseende lymfocytter med økt antall mitoser, tilblandet en del plasmaceller og granulocytter (fig 4). De atypisk utseende lymfocyttene var positive for B-cellemarkører. Immunhistokjemi og PCR viste monoklonalitet (fig 5) (9, 10). Det var ikke tilgjengelig ferskt materiale for væskestrømscytometrisk verifikasjon av monoklonalitet. Histologien ble også vurdert uavhengig av patologer i Lübeck og ved Mayo-klinikken, og endelig diagnose ble diffust storcellet B-lymfom. Klinikerne valgte imidlertid å la være å behandle, da jenta var frisk og manglet andre organ- og glandelmanifestasjoner. Hun går til kontroll hver tredje måned og er fremdeles frisk etter mer enn to års oppfølging. Dette illustrerer betydningen av at PCR-analyser ikke må vurderes isolert, men sammen med de kliniske og morfologiske funn og ev. andre tilleggsundersøkelser som er gjort. Monoklonalitet er ikke alltid ensbetydende med malignitet. Det kan tenkes at infeksjoner kan gi klonale populasjoner som dominerer og som vil fremstå som monoklonale bånd i gelen.

Figur 4   Lysmikroskopisk undersøkelse av lymfeknute fra pasient 2 (HE, 40 ⋅ ). Store deler av lymfeknutestrukturen var utvisket og inntatt av atypisk utseende lymfocytter, tilblandet en del plasmaceller og granulocytter

Figur 5   PCR fra pasient 2 for påvisning av monoklonalitet for immunglobulin tung kjede (9, 10). PCR-produktene fra en normal eller reaktiv lymfeknute vil ha varierende størrelse og fremstå som en sky ved gelelektroforese, mens PCR-produktene fra et malignt lymfom har samme størrelse og fremstår som et skarpt bånd i gelen. Brønn 1: DNA-størrelsesmarkør. Brønn 2: negativ kontroll. Brønn 3: reaktiv lymfeknute med polyklonalt mønster. Brønn 4: positiv kontroll (malignt B-cellelymfom) med monoklonalt mønster. Brønn 5 – 8: prøvemateriale fra pasient 1 med reproduserbart monoklonalt mønster

Sarkomdiagnostikk

Sarkomer er sjeldne maligne svulster som utgår fra kroppens bindevev og støttevev. De utgjør bare 1 – 2 % av alle kreftsvulster, og i Norge diagnostiseres det ca. 200 nye tilfeller hvert år. Disse svulstene skal ikke fjernes før man har en sikker diagnose. Morfologisk klassifikasjon baseres på finnålsaspirasjonscytologi eller grovnålsbiopsi og kan være svært vanskelig. Riktig diagnose er viktig fordi behandlingsoppleggene er forskjellige. Tilleggsundersøkelser som cytogenetiske undersøkelser og polymerasekjedereaksjon er ofte nødvendig, og vil kunne bidra til riktig diagnose og behandling (6, 11, 12). Det er nå kartlagt en rekke spesifikke translokasjoner i sarkomer som kan påvises ved polymerasekjedereaksjon (tab 2). Rundt 85 % av svulstene i gruppen Ewing/primitiv nevroektodermal tumor (PNET) har en t(11;22)(q24;q12)-translokasjon (13), mens opptil 95 % av de synoviale sarkomene har en spesifikk t(X;18)(p11;q11)-translokasjon (14, 15). De involverte genene koder for proteiner med ukjent funksjon.

Pasient 3. En 37 år gammel mann fikk påvist en smertefull tumor i høyre knehase. Finnålsaspirasjonscytologi og grovnålsbiopsi viste en småcellet malign tumor sannsynlig i Ewing/PNET-gruppen. Immunhistokjemisk undersøkelse viste positiv membranfargning for vimentin og O13 (fig 6). Pasienten fikk cytostatikabehandling etter Ewing-regime, men behandlingsresponsen var dårlig. Ved Ewings sarkom går ofte tumor i total regress etter preoperativ kjemoterapibehandling. Pasienten ble operert, og den histologiske undersøkelsen viste synovialt sarkom av overveiende monofasisk type. Diagnosen ble bekreftet med cytogenetisk analyse, som påviste den spesifikke t(X;18)-translokasjonen. Retrospektivt ble nedfryst materiale fra finnålsaspiratet og grovnålsbiopsien undersøkt med revers transkriptase-PCR (fig 7). mRNA fra grovnålsbiopsien ble vellykket ekstrahert, og ved revers transkriptase-PCR-teknikk klarte man å påvise fusjonsproduktet SSX-SYT av den spesifikke translokasjonen. Med denne teknikken får man ikke bare påvist at bestemte gensekvenser er til stede, men også om de er aktive. I dette tilfellet kunne altså PCR-teknikken ha bidratt til riktig diagnose primært, og pasienten kunne ha unngått preoperativ kjemoterapi.

Figur 6   Finnålsaspirasjonscytologi fra pasient 3. Småcellet malign tumor (a). Immunhistokjemisk undersøkelse viste membranøs farging for vimentin (b) og O13 (c)

Figur 7   Revers transkriptase-PCR fra pasient 3 for påvisning av fusjonsproduktet forårsaket av t(X;18)-translokasjon. Med denne teknikken blir RNA istedenfor DNA ekstrahert. Siden DNA-polymerase ikke kan jobbe med RNA-templater, må mRNA omdannes til cDNA ved hjelp av et enzym som heter revers transkriptase. Kvaliteten på cDNA sjekkes med en PCR (fig 7a), og deretter kjøres en ny PCR med primere mot fusjonsproduktet SSX-SYT forårsaket av t(X;18) (fig 7b). Med revers transkriptase-PCR får man ikke bare påvist tilstedeværelsen av bestemte gensekvenser, men også om disse er aktive. a)mRNA ble ekstrahert fra fersktfryst tumorvev fra finnålsaspiratet og grovnålsbiopsien. Kvalitativt cDNA ble kun påvist i grovnålsbiopsien (brønn 5). Brønn 1: DNA-størrelsesmarkør. Brønn 2: negativ kontroll. Brønn 3: positiv kontroll. b)Reproduserbare og forventede PCR-produkter ble påvist i grovnålsbiopsien (brønn 6 og brønn 7). Ikke noe produkt i brønn 4 og brønn 5 (finnålsaspiratet). Brønn 1: DNA-størrelsesmarkør. Brønn 2: negativ kontroll. Brønn 3: positiv kontroll

Påvisning av infeksiøse agenser

Polymerasekjedereaksjon er velegnet for påvisning av bakterielle og virale infeksjoner, spesielt der det på forhånd ikke er sikret materiale for dyrking. Latente infeksjoner må påvises med molekylærbiologiske teknikker, og av disse er polymerasekjedereaksjon mest sensitiv. Enkelte virus, slik som humant papillomavirus (HPV), kan ikke dyrkes i konvensjonelle medier, men må påvises ved antistoffstigning i serum eller genotyping i vev.

Pasient 4. En tre år gammel jente ble laserbehandlet for perianale vorter som ble oppfattet som kondylomer. Histologisk undersøkelse viste papillomatøs plateepitelhyperplasi med hyperkeratose (fig 8). Lysmikroskopisk var det ikke mulig å påvise noen HPV-forandringer. Eldre kondylomer kan mangle koilocytose og flerkjernede celler, som er typiske for en HPV-infeksjon. Biopsimaterialet ble derfor undersøkt med PCR med både konsensusprimere (16) og typespesifikke primere (17). HPV-DNA-type 6 ble påvist (fig 9). HPV 6 hører til de ikke-onkogene HPV-typer og finnes i kondylomer og lavgradige intraepiteliale neoplasier. Med PCR-teknikk fikk man bekreftet den kliniske diagnosen og at barnet var blitt adekvat behandlet.

Figur 8   Lysmikroskopisk bilde av perianal polypp fra pasient 4. Papillomatøs plateepitelhyperplasi med hyperkeratose. HPV-forandringer mangler

Figur 9   PCR fra pasient 4 for påvisning av humant papilloma-virus (HPV) med konsensusprimere Gp5+/6+ og typespesifikke primere for HPV 6. Brønn 5: DNA-størrelsesmarkør. Brønn 1 og brønn 7: positive kontroller. Brønn 4 og brønn 6: negative kontroller. Brønn 2 – 3: Reproduserbare og forventede PCR-produkter med konsensusprimerne. Brønn 8 – 9: Reproduserbare og forventede PCR-produkter med typespesifikke primere mot HPV 6

Forbytting eller kontaminasjon av vevsprøver

Heldigvis er det sjelden vi ikke får oppklart tilfeller av forbytting eller kontaminasjon av prøvemateriale i eller utenfor laboratoriet. Når ulykken først har skjedd, kan vi bruke polymerasekjedereaksjon til vevstyping av det materialet som vi antar er forbyttet eller kontaminert og sammenlikne det med pasientens vevstype.

Pasient 5. En 29 år gammel kvinne med diaré ble gastroduodenoskopert, og det ble tatt tre biopsier fra tynntarm. Histologisk undersøkelse viste fragment av adenokarsinom av intestinal type og normal tynntarmsslimhinne (fig 10). DNA ble ekstrahert fra adenokarsinomet og tynntarmsslimhinnen separat og vevstypet med allelspesifikk PCR for HLA-DQB1-gener med kommersielle analysesett som består av 16 PCR-reaksjoner (Dynal, Oslo, Cat.no. 553.01). Det ble påvist forskjellig vevstype i adenokarsinomet og tynntarmsslimhinnen (fig 11). Med PCR-teknikk ble dermed mistanken om kontaminasjon bekreftet – adenokarsinomet kunne ikke stamme fra pasienten.

Figur 10   Lysmikroskopisk bilde av tynntarmsbiopsier fra pasient 5 (HE, 2,5 ⋅ ). Et fragment av adenokarsinom av intestinal type (til venstre) og to fragmenter av normal tynntarmsslimhinne (til høyre)

Figur 11a og b   Allelspesifikk PCR fra pasient 5 for typing av HLA DQB1-gener. Brønn 2 – 17: 16 PCR-reaksjoner. Brønn 1: DNA-størrelsesmarkør.a) Det øverste gelbildet er fra adenokarsinomet.b) Det nederste er fra normal tynntarmsslimhinne. De største fragmentene representerer en intern kontroll på DNA. a)Her foreligger det forventede PCR-produkt i brønn 2 og 6 – 10, som gir vevstypen DQB1*0201,2 og DQB1*0301. b)Det forventede PCR-produkt i brønn 3, 4 og 13, som gir vevstypen DQB1* 0602,10 og DQB1*0402. Med PCR-teknikk har vi påvist at det i dette tilfellet har foreligget en kontaminasjon, siden adenokarsinomet og tynntarmsslimhinnen har forskjellig vevstype og dermed ikke kan tilhøre samme pasient

Polymerasekjedereaksjon er en svært sentral teknikk i molekylærbiologisk forskning og diagnostikk, og har i økende grad overtatt etter andre mer tidkrevende og kostbare molekylærbiologiske teknikker som Southern blot og in situ-hybridisering. Den tilfredsstiller alle krav til en god diagnostisk test. Den er enkel å utføre, rask, relativt rimelig og har bred anvendelse. Teknikken er nyttig for å påvise sykdomsgener og infeksiøse agenser. Applikasjonsområdene vil øke etter som stadig nye gener blir klonet og sekvensert. I diagnostisk patologi har polymerasekjedereaksjon størst betydning i cancerdiagnostikken. Disse analysene kan gi både diagnostisk og prognostisk informasjon. I tilfeller der cytologi- eller histologimaterialet er sparsomt eller av for dårlig kvalitet for en sikker morfologisk diagnose, kan polymerasekjedereaksjon bekrefte om en tumor er malign og bidra til å subklassifisere svulsten. Teknikken kan også brukes til å påvise kreft i tidlig fase, evaluere kirurgiske reseksjonsrender, påvise resttumor eller tidlig tilbakefall av tumorsykdom (minimal residual disease). Den diagnostiske nytten er først og fremst knyttet til maligne svulster som har spesifikke translokasjoner, slik som lymfomer og sarkomer (tab 1, tab 2). Karsinomer har mer komplekse karyotyper og er derfor ikke egnet for molekylærbiologisk diagnostikk. Før PCR-analysene rekvireres, må man altså ha en formening om hvilke kromosomavvik man skal lete etter. Polymerasekjedereaksjon er ikke egnet til screening, fordi bare små områder av det humane genomet undersøkes. Ved cytogenetiske undersøkelser blir derimot hele karyotypen kartlagt. Ved PCR-analyser må man velge primere for hvert enkelt kromosomrearrangement som sk

al påvises. Cytogenetiske analyser er imidlertid mer tidkrevende enn polymerasekjedereaksjon, svar kan ikke foreligge før etter 2 – 3 uker. Det trengs relativt mer vev og kun ferskt materiale kan analyseres. Resultatet av en PCR-undersøkelse kan foreligge i løpet av 1 – 2 dager. PCR-teknikken er langt mer anvendelig i diagnostisk patologi. Både ferskt, fryst, formalinfiksert og parafininnstøpt materiale og fargede vevssnitt og celleutstryk kan analyseres. I prinsippet er det nok med en enkelt celle, fordi det ved en polymerasekjedereaksjon blir kopiert opp mange millioner nye kopier slik at avviket lett kan påvises.