Maligne svulster er karakterisert ved infiltrerende vekst og mulighet til å metastasere. Spredningsveier inkluderer ofte serøse overflater, spesielt ved brystkreft og eggstokkkreft (1). Funn av maligne celler i serøse væsker er oftest ensbetydende med spredning. Dette innebærer generelt en dårlig prognose, og pasienten må ha omfattende behandling. Unntaket er når kreft i eggstokkene vokser gjennom peritoneum, slik at kreftcellene skilles direkte ut i peritonealhulen.
Det er ofte vanskelig å diagnostisere kreftceller i serøse væsker, fordi epiteliale kreftceller kan likne reaktivt mesotel. Dessuten reagerer mesotelceller lett på forskjellige stimuli, som kirurgiske inngrep, stråle- og cytostatikabehandling (1). Man finner da reaktive forandringer både i kjerne og cytoplasma i tillegg til en livlig mesotelcelleproliferasjon som lett kan feiltolkes som kreftceller (1, 2). Siden eggstokkene utvikles fra mesotel, er det spesielt ved eggstokkreft vanskelig å skille mellom kreftceller og reaktivt mesotel. Likeledes kan «endosalpingiose», som er godartede forandringer i mesotel, lett feildiagnostiseres som høyt differensiert serøst karsinom både i cytologisk materiale (3 – 8) og i biopsimateriale (9). Mange studier omhandler maligne og benigne celler i serøse væsker ved morfologisk og immunhistokjemisk diagnostikk.
Diagnostiske metoder
Immunhistokjemisk karakterisering av epitel og mesotelceller i væsker
En rekke forskjellige markører blir brukt for å skille mellom mesotel- og epitelceller ved immunhistokjemisk teknikk. De mest vanlige antistoffene inkluderer karsinoembryonalt antigen (CEA), LEU-M1 (CD15), Ber-EP4, og B-72.3 (TAG 72) (10 – 26), alle er markører for epitelceller. Sensitiviteten til CEA-immunfarging er 0 – 100 %. Det er imidlertid ikke mulig å sammenlikne resultatet av disse rapportene, fordi man noen steder har brukt polyklonalt anti-CEA, mens andre har brukt monoklonalt anti-CEA. De fleste rapportene gir heller ikke opplysninger om antistoffenes spesifisitet eller utgangspunktet til svulstene som er diagnostisert.
Figur 1 Celleblokk av ascitesvæske med lymfocytter, mesotelceller og karsinomceller med tydelig membranfarging for Ber-EP4
Det samme gjelder for Ber-EP4-undersøkelsene, hvor sensitiviteten varierer fra 32 % til 100 % og spesifisiteten fra 12 % til 100 % (27) (fig 1). I ni studier er imidlertid spesifisiteten så høy som 98 %. B-72.3 er ett av noen få antistoffer som har vist relativt konstant spesifisitet både i histologiske og i cytologiske prøver (fig 2). Spesifisiteten varierer mellom 96 % og 100 %, mens sensitiviteten varierer fra 69 % til 100 %. LEU-M1 er en markør som av mange betraktes som spesifikk for adenokarsinomceller, selv om sensitiviteten er relativt lav (60 %).
Figur 2 Ascitesvæske med et stort antall karsinomceller med både membranøs og cytoplasmatisk immunreaktivitet for B-72.3
De mest brukte mesotelcellemarkørene er HMBE-1, calretinin og trombomodulin (28). Sensitiviteten varierer fra 60 % til 90 % og spesifisiteten er mindre enn 50 %. Epitelmembranantigen (EMA) kan påvises både i maligne mesoteliomer og i adenokarsinomer, men lokalisering av antistoffbindingen varierer. Den er tykk membranøs i mesoteliomer og ofte tynn membranøs og cytoplasmatisk i adenokarsinomer (1). Andre markører, som lektiner, fibronektin og desmin, er rapportert som epitel- eller mesotelspesifikke i enkelte studier (18, 29 – 32). Selv om kombinasjoner av ovenfornevnte markører øker presisjonen, har man ikke lykkes i å komme frem til et panel med 100 % sensitivitet og spesifisitet.
Et problem med lysmikroskopisk evaluering av immunhistokjemisk og immuncytokjemisk undersøkelse er at evalueringen er subjektiv. Teoretisk burde væskestrømscytometrisk immunfenotyping ha store fordeler fordi metoden er objektiv og instrumentets registrering av immunfluorescens er langt mer pålitelig enn øyets. På tross av metodologiske problemer har vi god erfaring med å skille maligne epiteliale cellekloner fra reaktivt mesotel ved væskestrømscytometri (fig 3).
Figur 3 Væskestrømscytometrisk undersøkelse av ascitesvæske med dobbeltfarging for N-cadherin (y-aksen) og Ber-EP4 (EP4, x-aksen). I høyre nedre kvadrant (rød sirkel) finner man celler som bare er positive for Ber-EP4, forenlig med karsinomceller
Evaluering av DNA-innhold i celler
En rekke forfattere har vurdert betydningen av DNA-analyse ved diagnostisering av maligne celler i væsker (33 – 42), og sensitiviteten til DNA-ploiditetsmåling har vært sammenliknet med immunhistokjemisk påvist p53 (33), Ki-67 (34) og forskjellige epitelmarkører (35, 36) samt med morfologisk diagnostikk (36). DNA-aneuploide populasjoner er påvist i 50 % til 65 % av maligne væsker i de fleste av de ovenfornevnte studier. I en undersøkelse er det gjort både DNA-poliditetsmåling og påvisning av CEA-positive epiteliale celler (43), uten at man kan trekke noen sikker konklusjon. Disse resultatene er lite oppløftende, først og fremst pga. lav sensitivitet i forhold til den mer sensitive og kostnadseffektive immunhistokjemiske metode.
Cellebiologiske metoder
Cytogenetisk undersøkelse
I de fleste studiene har man enten benyttet tradisjonell cytogenetisk kromosomal analyse eller fluorescent-in situ-hybridiseringsteknikk (FISH) (44 – 55). I to av studiene har forfatterne beskrevet forekomsten av små, doble fragmenter av kromatin (double minutes) i metastaser fra ovarialkarsinomer og andre karsinomer (49, 50). Ved hjelp av FISH-teknikk ble DNA-aneuploiditet for kromosom 8 oppdaget i 75 % av brystkarsinomer (44) og 20 % av pancreaskarsinomer (45). Avvik i kromosomene 1, 3, 6, 7, 10 og 12 ble oppdaget i ovarialkarsinom når man benyttet cytogenetisk kromosomanalyse (55), mens andre kromosomer – 8, 11, 17, 18, X og Y – var avvikende i tumorceller fra andre tumortyper (45, 48, 51, 53). Resultatene var mindre lovende for malignt mesoteliom pga. problemer med å diagnostisere disse cytologisk (54).
Studier med proliferasjonsmarkører
Man kjenner i dag mer enn 100 ulike gener som deltar i cellenes regulering av vekst og differensiering, men det finnes relativt få studier der man har benyttet proliferasjonsmarkører på maligne celler i serøse væsker. I en studie fant man forhøyet Ki-67-verdi hos pasienter med redusert overlevelse når man benyttet 20 % som grenseverdi (34), mens forfatterne av en annen studie fant korrelasjon mellom Ki-67 og DNA-aneuploiditet (56). Ved å benytte prolifererende cellekjerneantigen (PCNA) ble det funnet signifikant høyere verdi i maligne væsker sammenliknet med benigne (57). I andre studier har man benyttet «cellekjerneorganiseringsmarkører» (AgNOR), og denne metoden kunne også skille mellom benignt mesotel og maligne celler, selv om sensitiviteten var relativt lav (58 – 60).
Genotypiske og fenotypiske forandringer ved metastasering
For å metastasere må en svulst kunne vokse ukontrollert – infiltrere omkringliggende bindevev, blod og lymfekar, transporteres med blod, lymfe og/eller vevsvæsker, adherere til og penetrere karvegg, invadere mottakerorganet og etablere dattersvulst. Hvert av disse trinnene forutsetter helt spesielle egenskaper hos tumorcellene i form av biokjemiske prosesser inne i dem, med produksjon av blant annet signalmolekyler, enzymer og/eller overflatereseptorer.
Kombinasjon av morfologisk undersøkelse og et panel av forskjellige immunhistokjemiske antistoffer mot epitel- og mesotelmarkører fører til korrekt diagnose i over 90 % av tilfellene (61). I tillegg vil proliferasjonsmarkører (Ki-67, PCNA), DNA-ploiditet og kromosomanalyse bidra til å karakterisere vanskelige tilfeller (62). Selv om man har tilstrebet å analysere forskjeller mellom primærtumor og de respektive metastasene, foreligger lite relevant litteratur om metastasering til serøse hulrom og betydningen for overlevelse og behandling. Dette kan delvis forklares ved at materialene er heterogene, med primærtumorer i forskjellige lokalisasjoner.
Apoptose
Apoptose har stor betydning for tumorvekst. Det foreligger ingen studier hvor apoptose i tumorceller i væsker er undersøkt.
Tumorsuppressorgener, onkogener og cellesyklusproteiner
Den diagnostiske rollen til p53, det mest kjente suppressorgenet, blir oftest påvist ved immunhistokjemi (33, 57, 63 – 68), og i de fleste studiene finner man at mutasjoner i p53-genet er relatert til kreftspredning og dårlig prognose. Imidlertid er sensitiviteten til immuncytokjemisk påvist p53-mutasjon lav (33), samtidig som enkelte også har funnet holdepunkter for p53-mutasjon i benigne mesotelceller. Derfor er det blitt reist tvil om betydningen av immuncytokjemisk påvist p53-protein i væsker (68). Det foreligger ingen studier hvor man har undersøkt p53-genet i tumorceller ved hjelp av molekylære studier. Man vet at det normale p53-proteinet induserer transkripsjon av en gruppe hemmere av cyklinavhengige kinaser som er vesentlig for celleproliferasjon. En av disse er p21. p21- og MDM-2-immunreaktivitet har vært vurdert i ett arbeid (64), mens en annen rapport har beskrevet p21-immunreaktivitet i benigne og i maligne celler i væsker (69). Det er derimot ingen publikasjoner om andre proteiner som er involvert i cellesyklus, som cyklinavhengige kinaser som p15, p16, p27, retinoblastomgenprodukter og dets relaterte proteiner, cykliner eller CDKs (cyklinavhengige kinaser).
Protoonkogener
Disse er involvert i de ulike trinnene i signaloverføring i cellen. Det som kjennetegner kreftceller, er at protoonkogenene kommer ut av kontroll, de blir da kalt onkogener. Noen få publikasjoner omhandler cellulære onkogener i tumorceller i væsker. En rapport beskriver c-myc-genamplifikasjon i en liten undergruppe av pancreaskarsinomer (45). Ved hjelp av «Northern blotting» og in situ-hybridiseringsteknikk er c-myc-mRNA påvist både i benigne og i maligne væsker (70). I et arbeid fant man c-erbB-2 amplifikasjon i både benigne og i maligne celler i en undersøkelse, men man økte sensitiviteten ved å inkludere antistoffer mot p53 og B-72.3 (69). I en annen studie (71) ble c-erbB-2-onkogenet påvist i metastaser fra adenokarsinomer i mamma og eggstokker, men ikke i benigne og maligne mesotelceller. Noen få rapporter beskriver forekomst av K-ras- og H-ras-onkogenene i metastaser til serøse væsker fra pancreas- og mammakarsinomer (72 – 75).
Adhesjonsmolekyler
En rekke forskjellige adhesjonsmolekyler deltar i metastaseringsprosessen, deriblant CD44. CD44 er en gruppe glykoproteiner med ti variable eksoner (kodede områder av DNA) og et stort antall forskjellige isoformer som har forskjellige funksjoner, slik som «lymfocytt-homing», epiteladhesjon og makrofagaktivering. I to arbeider er det vist at enkelte av CD44-isoformene har stor tumorspesifisitet, og CD44 kan vise seg å ha en diagnostisk rolle ved påvisning av maligne celler i serøse væsker (76, 77). Ved hjelp av RT-PCR-teknikk var isoform 7 av CD44 til hjelp ved diagnostisering av kreft, men ikke isoform 6 av CD44 (76). Ved immunhistokjemisk teknikk er det motstridende resultater vedrørende CD44-isoformenes evne til å identifisere kreftceller (77, 78).
E-cadherin-adhesjonskompleks
Cadheriner er transmembrane glykoproteiner som er viktige i celle-til-celle-adhesjon, og redusert syntese ser ut til å være nødvendig for enkelte karsinomers evne til å infiltrere bindevev. Kliniske studier har vist at tap av cadheriner indikerer dårlig prognose for en rekke krefttyper. To begrensede studier beskriver immuncytokjemisk påvist E-cadherin-ekspresjon i tumorceller i væsker, men konklusjonen er ikke entydig (79, 80). Ikke i noen studier er det benyttet molekylærgenetiske teknikker til å evaluere E-cadherin i væsker. Det er heller ikke publisert noen undersøkelse av cateniner, som er neste ledd i signaloverføringskjeden.
Selektin
Dette er også transmembrane glykoproteiner med karbohydrategenskaper, men det er ikke publisert noen arbeider om selektinstatus i væsker.
Integriner
Dette er en gruppe transmembrane glykoproteiner som har viktige funksjoner, først og fremst ved adhesjon til ekstracellulær matriks og migrasjon gjennom denne. En rekke kliniske og immunhistokjemiske undersøkelser har vist endringer i integrinekspresjon ved tumorprogrediering, noe som kan indikere at integrin kan ha en viktig funksjon ved kreftspredning. Få arbeider er gjort på kreftceller i væsker. Ekspresjon av ßbr-1-, ßbr-3- og ßbr-4-integriner i normalt og reaktivt mesotel og i maligne mesoteliomer er undersøkt i ett arbeid (81), mens man i en annen studie har påvist tilstedeværelse av ßbr-1-integrin i metastaser fra kolorektale karsinomer (82).
CAM
Dette er en familie av adhesjonsmolekyler som finnes på celleoverflater og som binder celler til hverandre og til matriks. ICAM-1 er påvist i mesotelceller fra væsker som inneholder både benigne og maligne celler (83). ICAM-1-immunreaktivitet er også rapportert i metastaser fra ventrikkelkarsinom (84), men det finnes ikke noen studier der man har rapport V-CAM-status i væsker.
Karbohydratantigener
Alle celler har sukkermolekyler på overflaten, og endringer i disse strukturene er vist å ha prognostisk verdi for en rekke forskjellige tumortyper. Det har lenge vært kjent at mange sukkerstrukturer endres betydelig under kreftutvikling, og det har vært antatt at de hadde adhesive egenskaper. Oppdagelsen av selektin-karbohydrat-bindingen er den til nå sterkeste indikator på dette. Blokkering av både karbohydrater og selektiner har i in vitro-forsøk resultert i hemming av adhesjonen mellom kreftceller og endotel. En rekke studier omhandler karbohydrattumorassosierte antigener i væsker (85), men det foreligger kun begrenset informasjon om karbohydratstrukturene i karsinomceller. CA-19-9 (sialyl Le A) er rapportert å ha høy spesifisitet, men moderat sensitivitet ved å skille adenokarsinomer fra maligne mesoteliomer (28). Sensitiviteten til CA-19-9 var sammenliknbar med den til EMA, CEA og CA-125 i metastaser fra ovarialkarsinom (86). Sialyl Le A og sialyl Le X er også påvist i kolorektale karsinomceller i væsker (82).
Proteaser
Tumorinfiltrasjon gjennom basalmembranen og ut i omgivende vev er et av de viktigste kriteriene for malignitet. Basalmembranen er en kontinuerlig matriks av protein, glykoprotein og proteoglykan som må nedbrytes før tumor kan infiltrere. Proteasene skilles ut som inaktive molekyler som kan aktiveres av proteiner som produseres i normale celler, som for eksempel fibroblaster. I normalt vev er inhibitorer av disse proteolytiske enzymene like viktige som proteasene, og prosessen foregår kontrollert som en proteolytisk kjedereaksjon, og har i så måte mange likhetstrekk med blodkoagulasjon.
Matriksmetalloproteinaser er en gruppe enzymer som produseres av tumor og av fibroblaster og endotelceller omkring tumor. De inndeles etter sin substratspesifisitet. Tilstedeværelse av metalloproteinaser (MMP) og deres inhibitorer (TIMP) i væsker er rapportert i to undersøkelser (87, 88), men betydningen av MMP- og TIMP-ekspresjon på maligne celler i væsker er ikke klarlagt.
Catepsin
Bare i …en publikasjon er det beskrevet forekomst av latent form av catepsin B i pleuravæske med metastase fra mammakarsinom (89). Det foreligger så vidt vi vet ingen studier vedrørende catepsin D i væsker.
Vekstfaktorer
Transformerende vekstfaktor _ (TGF-_) og epidermal vekstfaktor (EGF) i væsker har bare vært omtalt i ‘n studie (90), hvor man påviste TGF-_, men ikke EGF ved hjelp av radioimmunoassay og radioreseptorassayteknikk. Ingen studier er publisert med henblikk på forekomst av TGF- og EGF-reseptor i tumorceller.
Platederivert vekstfaktor (PDGF) og PDGF-reseptor er påvist i benigne og i maligne mesotelceller (91, 92) så vel som i pleuravæske fra pasienter med metastase fra lungekarsinom (93). Ingen undersøkelser med henblikk på PDGF-ekspresjon i metastatiske karsinomceller i væsker er publisert.
Fibroblastvekstfaktor (FGF)-ekspresjon i væsker har per i dag ikke vært publisert.
Andre markører for maligne celler
Telomeraseekspresjon er beskrevet i tumorceller i væsker ved hjelp av PCR- og TRAP-assay (94 – 96), med generelt høy sensitivitet og spesifisitet.
Angiogenese
Det er ikke publisert undersøkelser vedrørende VEGF-ekspresjon i tumorceller.
Multimedikamentresistens
Det er kun publisert ‘n rapport der man har sammenliknet betydningen av tre monoklonale antistoffer mot multimedikamentresistentrelatert P-glykoprotein (97). Undersøkelsen omfatter både vevsbiopsier og væsker.
Egne erfaringer
Diagnostisering av karsinomceller i serøse væsker er ofte et stort problem, og vi har nylig vist at et antistoffpanel bestående av Ber-EP4, B-72.3 og antistoffer rettet mot forskjellige karbohydratepitoper (61, upubliserte resultater) har meget høy spesifisitet og sensitivitet på formalinfiksert celleblokkmateriale. På dette materialet er calretinin den beste mesotelmarkøren. CEA har størst betydning ved diagnostiseringen av svulster utgått fra gastrointestinaltractus samt av og til ved spredning av brystkreft. Derimot har CEA liten betydning ved diagnostisering av ovarialkreft (61). Antistoff mot CA-125 har liten evne til å skille mellom ovarialkreftceller og mesotelceller på grunn av overlappende immunreaktivitet (61), sannsynligvis som følge av felles mesodermalt opphav. Foreløpige undersøkelser av vår gruppe har vist høy sensitivitet og spesifisitet for antistoffer rettet mot E-cadherin og _-, ßbr- og g-catenin ved diagnostisering av ovariekreft på celleblokkmateriale. På ferskt, ufiksert materiale finner vi at BerEP-4 og N-cadherin er gode markører for henholdsvis epitel- og mesotelceller. Disse antistoffene inngår derfor i vårt standardpanel ved væskestrømscytometrisk undersøkelse av bl.a. serøse væsker, en undersøkelsesmetode som er rask og kostnadseffektiv med høy sensitivitet og spesifisitet (ikke-publisert undersøkelse).
Prognostisk betydning av cellemarkørene har vi funnet for karbohydratstrukturen sialyl-Lewisx (98), som blir oppregulert ved metastatisk prostatakarsinom. Imidlertid tyder foreløpige immunocytokjemiske observasjoner på at aktivering av metalloproteinasene MMP-2, MMP9 og MT1-MMP og proteinaseinhibitoren TIMP-2 korrelerer med dårlig overlevelse av ovariekreft (ikke publisert).
Eksperimentelt kan molekylærbiologisk teknikk gi viktig tilleggsinformasjon, men metodene er ressurskrevende og egner seg foreløpig ikke for rutinediagnostikk.
Konklusjon
Maligne cellers spredningsvei inkluderer ofte serøse hulrom, og det er viktig å diagnostisere slik spredning tidligst mulig. Diagnostisering av maligne celler i serøse væsker kan være vanskelig fordi epiteliale kreftceller har stor likhet med mesotelceller. Derfor kan man ha stor nytte av immuncytokjemisk teknikk med antistoffer som karakteriserer epitel versus mesotel. Som følge av egne erfaringer vil vi anbefale et panel bestående av antistoffene BerEP-4 og B-72.3, karbohydratantigener og E-cadherinkompleksprotein i tillegg til calretinin ved utredning av mulig kreftspredning til serøse væsker. I vanskelige tilfeller kan væskestrømscytometrisk undersøkelse være til hjelp.
Til tross for store fremskritt innen diagnostisering og behandling av kreft, dør de fleste pasientene av metastaser. Økt kunnskap om metastaseringsprosessen, som omfatter en rekke forskjellige hendelser, er derfor viktig. Hvert av trinnene i denne prosessen forutsetter helt spesielle egenskaper hos kreftcellene, som har sitt organiske grunnlag i form av biokjemiske prosesser med bl.a. produksjon av signalmolekyler, enzymer og overflatereseptorer. Kreftspredning til serøse hulrom er ledd i metastaseringsprosessen, og på tross av moderne molekylærbiologiske metoder er fortsatt mye ukjent.
