Prekondisjonering – hjertets egne forsvarsmekanismer ved iskemi

Iskemisk stress og utvikling av celleskade

Figur 1   Skjematisk illustrasjon som viser utvikling av iskemisk celleskade. Ved iskemi brytes cellens energilagre ned og metabolitter opphopes intracellulært. Økt osmotisk belastning samt aktivering av enzymer medvirker til skade på cellemembranen, organeller og cytoskjelett

Figur 2   Skjematisk illustrasjon som viser at prekondisjonering forsinker utvikling av celledød (infarkt) under iskemi. Prekondisjonering øker cellenes toleranse mot iskemi: cellene tåler lengre tid med iskemi før de dør

Iskemi (isch-aemia, gresk) betyr å ”holde tilbake blod” (7). Det er dog vanskelig å enes om en kort definisjon, fordi redusert blodgjennomstrømning fører til både biokjemiske, metabolske, funksjonelle og morfologiske endringer (8). Reduksjon i blodforsyningen innebærer to aspekter: For det første en begrenset tilgang på både oksygen og metabolske substrater, for det andre redusert utvasking av ioner og metabolitter. Den iskemiske responsen i hjertemuskelen er karakterisert ved redusert oksygenforbruk (O ₂ ), omlegging fra aerob til anaerob metabolisme og redusert kontraktil funksjon (1). Redusert energiproduksjon fører til nedbrytning av cellens energilagre (adenosintrifosfat (ATP) og kreatinfosfat). Kombinert med redusert utvasking vil dette føre til akkumulering av metabolske katabolitter og biprodukter. Energiavhengige ionepumper (ATP-aser) vil lide, og det oppstår intracellulære ioneforstyrrelser (økt intracellulær konsentrasjon av natrium og kalsium og tidlig utstrømming av kalium), med endringer i ionegradienter og membranpotensial (1). Videre kan flere mekanismer medvirke til skade på cellulære strukturer som cellemembraner, cytoskjelettet og intracellulære organeller (1, 9) (fig 1). Økt osmotisk belastning gir intracellulært ødem, med mulighet for distorsjon og ruptur av ulike strukturer. Direkte skadelige effekter kan også oppstå på grunn av aktivering av intracellulære enzymer. Proteaser kan angripe proteiner i cytoskjelettet og lipaser kan angripe fosfolipider i cellemembranen. Detergenteffekter av lipider og fettsyremetabolitter kan forekomme, samt produksjon av substrater for danning av O ₂ -radikaler. Dette kan føre til ruptur av cellemembranen og celled&

oslash;d.

Prekondisjonering – en adaptiv respons på ulike stresstimuli

Fenomenet prekondisjonering ble først beskrevet eksperimentelt i hundehjerter (4). Man hadde oppdaget at flere påfølgende kortvarige iskemiperioder førte til mindre akkumulert skade (nekrose) enn én tilsvarende periode med vedvarende iskemi. Murry og medarbeidere (4) utsatte derfor myokard for gjentatte perioder med kortvarig regional iskemi. Noe overraskende fant de at dette gav økt toleranse mot en senere lengrevarende iskemiperiode. Infarktstørrelse etter en 40 minutters iskemiperiode ble redusert fra 29 % uten prekondisjonering til 7 % med prekondisjonering. Dette kunne ikke forklares ved økt blodgjennomstrømning via kollateraler. Forfatterne konkluderte med at de hadde oppdaget et nytt fenomen som utløses av iskemi, og som gir beskyttelse mot iskemisk celledød.

Det er viktig å være klar over at prekondisjonering kun forsinker utvikling av celledød, slik at hvis den påfølgende iskemieperioden er lang, nok vil likevel alt vevet dø (fig 2) (4). I tillegg er den beskyttende effekten av prekondisjonering av begrenset varighet. Effekten er tidsavhengig og kan deles inn i to faser (fig 3, fig 4). Den ”tidlige fasen” kommer umiddelbart, gir kraftig beskyttelse, men varer kun 1 – 2 timer (10). Den ”sene fasen” oppstår omtrent 24 timer etter det initiale stimulus, gir noe dårligere beskyttelse, men varer til gjengjeld bortimot 72 timer (10, 11).

Et karakteristisk trekk ved prekondisjonering er ”hukommelsen”. Cellene ”husker” at de er blitt utsatt for stress, og blir mer motstandsdyktige mot et senere kraftigere stresstimulus. Det initiale stimulus induserer altså endringer i cellene som varer en viss tid (opptil to timer ved ”tidlig fase” og 24 – 72 timer ved ”sen fase”). Enkelte hevder at det må være ulike cellulære prosesser som ligger til grunn for ”tidlig fase” og ”sen fase”, spesielt fordi fenomenene atskiller seg fra hverandre med henblikk på tid og grad av proteksjon. Mye taler imidlertid for at de cellulære prosessene er felles, men at adaptasjonen er observert på ulike tidspunkter. Imidlertid vil nok de cellulære mekanismene kunne variere noe, avhengig av type og grad av induksjonsstimuli. Også grad av stimuli kan være av betydning for den adaptive responsen. Enkelte hevder at prekondisjonering er et alt-eller-intet-fenomen: Enten er cellene prekondisjonert, eller så er de det ikke (25). Alternativt kan prekondisjonering indusere en gradert respons, avhengig av hvor kraftig et induksjonsstimulus er (26). Det er mulig at den enkelte celle reagerer med en alt-eller-intet-respons, mens organet som helhet fremviser en gradert respons avhengig av hvor mange celler som er involvert.

Figur 3   Skjematisk illustrasjon av eksperimentell protokoll for ”tidlig fase” og ”sen fase” av iskemisk prekondisjonering (hvitt = iskemi, sort = reperfusjon)

Figur 4   Skjematisk illustrasjon av ”tidlig fase” og ”sen fase” av prekondisjonering. Den ”tidlige fasen” kommer umiddelbart, varer 1 – 2 timer, og kan redusere celledød/infarkt til under en tredel av det som ville forekommet uten prekondisjonering. Den ”sene fasen” oppstår etter omtrent 24 timer, varer bortimot 72 timer, og kan redusere celledød/infarkt til omtrent halvparten

I dag mener man at prekondisjonering representerer et generelt adaptivt fenomen. Begrepet er blitt utvidet til å omfatte ulike induksjonsstimuli og beskyttelse mot ulike former for cellulær dysfunksjon (tab 1). I hjertet er det vist at prekondisjonering i visse tilfeller kan beskytte mot postiskemisk dysfunksjon (stunning) og redusere arytmifrekvens (12), samt redusere en spesiell form for energikrevende programmert celledød (apoptose) (13). Kortvarig regional iskemi i ett kargebet kan dessuten indusere beskyttelse mot hjerteinfarkt ved en senere okklusjon i naboområdet, muligens forårsaket av diffusjon av signalsubstanser fra det iskemiske området til omkringliggende vev (14). Beskyttelse mot hjerteinfarkt kan også induseres ved kortvarig arteriell okklusjon i andre organer (tarm, nyre eller skjelettmuskel i rotte og kanin), såkalt fjern (remote) prekondisjonering, trolig mediert via blodbårne signalsubstanser (hormoner) og/eller nervesystemet (15, 16). En beskyttende effekt tilsvarende iskemisk prekondisjonering kan også induseres ved kortvarig forbehandling med visse farmakologiske agenser (tab 2). I tillegg kan andre typer fysiske stresstimuli enn iskemi indusere prekondisjonering. Kortvarige perioder med rask (stimulert) hjertefrekvens eller forbigående volumoverbelastning (strekk) av myokard kan gi ”tidlig fase” av proteksjon (17, 18). Kortvarig økt temperatur (varmebehandling/”heat shock”: 42 ˚C i 15 minutter) kan gi ”sen fase” av proteksjon (11). Fysisk trening (1 – 3 dager med perioder på tredemølle) kan indusere økt iskemisk toleranse i hjertet hos rotter (19). Av mer besynderlig karakter kan nevnes at eksponering for elektromagnetisk felt er vist å øke hjertecellers toleranse mot ano

ksi (20). Videre er det holdepunkter for at prekondisjonering også eksisterer i andre organer, blant annet i sentralnervesystemet (21), skjelettmuskel (22), lunge (23) lever (24) og tynntarm, samt i endotelceller (12).

Cellulær adaptasjon – mulige forsvarsmekanismer

Det har vært stor interesse for å kartlegge hvilke mekanismer som ligger bak fenomenet prekondisjonering. I eksperimentelle studier har man forsøkt å finne en felles nøkkelfunksjon som kan forklare den beskyttende effekten. Det er viktig å være klar over at eksperimentelle dyreforsøk utføres i til dels svært forskjellige modeller: fra våkne eller anesteserte store dyr til isolerte hjerter, isolerte celler, genmanipulerte dyr og cellelinjer. Med disse begrensninger vil jeg prøve å gi en kortfattet presentasjon av de mest aktuelle mekanismene for prekondisjonering i hjertet.

Initialt fant Murry og medarbeidere (27) at prekondisjonering reduserte metabolsk aktivitet under den langvarige iskemiperioden slik at cellens energilagre (ATP) ble bedre preservert. Man har ikke klart å finne en enkel(t) årsak til det reduserte ATP-forbruket. Det kan ikke alene forklares via redusert kontraktil funksjon (postiskemisk stunning) eller redusert aktivitet av energikrevende ionepumper (ATP-aser). Den ATP-sparende effekten er relativt kortvarig (minutter), og hva den betyr for cellenes overlevelse, kan også diskuteres (28).

I den videre signalveien tror man at posttranslasjonell modifikasjon av proteiner (translokasjon og fosforylering) spiller en rolle. Som intracellulær mediator står enzymet proteinkinase C (PKC) sentralt (30), sannsynligvis i samspill med tyrosinkinase (TK) (31) og mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK) (32). Disse kinasene kan fosforylere ulike proteiner og dermed påvirke proteinenes funksjon. Ved lengrevarende iskemi ser det ut til at fosforyleringsgraden av ulike proteiner reduseres. Prekondisjonering kan motvirke dette, noe som sannsynligvis har en gunstig effekt (32). Ved ”tidlig fase” av prekondisjonering tror man at den cellulære ”hukommelsen” har sammenheng med translokasjon av PKC fra cytosol til cellemembraner. Dette gir raskere aktivering av PKC under den langvarige iskemiperioden (30), men etter en stund vil PKC retranslokeres til cytosol og hukommelsen forsvinner.

I dag kjenner man ikke med sikkerhet identiteten til endeeffektoren for prekondisjonering. Man vet ikke hvilke cellulære strukturer som er involvert, ei heller om påvirkningen skjer via endring i funksjon (aktivitet) eller struktur (mengde og/eller organisering). Aktuelle muligheter er ionekanaler, spesielt ATP-sensitive kalium (K ⁺ )-kanaler (K _ATP -kanaler) i cellemembranen. Nyere forskningsresultater indikerer at aktivering av mitokondrielle K _ATP -kanaler er viktig, kanskje i samspill med proteiner i cytoskjelettet (33). Nøyaktig hvorfor aktivering av disse kanalene forårsaker en beskyttende effekt er ukjent. Åpning av K _ATP kanaler gir økt K ⁺ -utstrømning og endrer ionegradienter og elektrokjemisk potensial over mitokondriemembranen. Muligens fører dette til mindre opphopning av Ca ²⁺ i mitokondriene eller til at cellens energilagre (ATP) bevares bedre.

Det er også kjent at ulike stresstimuli kan stimulere nysyntese/ekspresjon av en rekke cellulære proteiner (6, 11, 34). Ved ”sen fase” av prekondisjonering har man satt den cellulære hukommelsen i sammenheng med slik nysyntese. Et subletalt stress (iskemi eller varmebehandling) kan indusere økt ekspresjon av cytoprotektive proteiner og dermed forårsake økt toleranse mot et senere stress (iskemi) (11). Det vil ta en viss tid før et nytt protein er ferdig syntetisert, tilsvarende tar det en viss tid før proteksjonen oppstår.

I første rekke har ”heat shock”-proteiner (HSP) vært diskutert. Dette er en familie av proteiner (HSP27, HSP60, HSP70, HSP90) som er involvert i folding og funksjon av andre cellulære proteiner (6, 35), og man mener de bidrar til å stabilisere cytoskjelettet (35). HSP27 kan beskytte mot depolymerisering av aktin (33), mens HSP60 beskytter mitokondriene. Induksjon av ulike antioksidantenzymer (mangansuperoksiddismutase, katalase, glutationperoksidase/-reduktase, malondialdehyd, alkylhydroperoksidreduktase) kan beskytte cellen mot oksidativ skade/stress (6).

Raske stressresponsgener (immediate early genes: c-fos, c-myc, Egr-1, jun-B) og andre transkripsjonsfaktorer (spesielt NF- κ B) (36) er muligens også involvert.

Enzymet nitrogenmonoksidsyntase kan ha en sentral rolle (36), eventuelt også andre proteiner (enzymet hemeoksygenase-1, metabolske enzymer, proteiner involvert i Ca ²⁺ -regulering i sarkoplasmatisk retikulum, angiogenetiske vekstfaktorer og ubiquitin). Helt nylig har man tatt i bruk molekylærbiologiske teknikker for å undersøke (screene) hvilke genprodukter som oppviser endret ekspresjon etter prekondisjonering. Kanskje finnes en ukjent endeeffektor?

Figur 5   Skjematisk illustrasjon som viser aktivering av intracellulære signalveier ved prekondisjonering (5). Substanser som binder seg til inhibitoriske G-proteinkoblede reseptorer (adenosin, bradykinin, adrenalin, opioidpeptider) spiller en sentral rolle som ”triggere” i prekondisjonering. Som ”mediator” står enzymet proteinkinase C (PKC) sentralt, sannsynligvis i samspill med tyrosinkinase (TK) og mitogenaktiverte proteinkinaser (MAPK). Kinasene fosforylerer antakelig en eller flere ”endeeffektor(er)”, slik at cellen får økt toleranse mot iskemi. Endeeffektoren(e) er ikke klarlagt, men kan være en ionekanal (K _ATP -kanaler) og/eller proteiner i cytoskjelettet. (DAG = diacyl glyserol, PIP2 = fosfatidyl inositol difosfat, PLC = fosfolipase C, PLD = fosfolipase D)

Downey og medarbeidere (29) var de første som studerte mulig aktivering av intracellulære signalveier (fig 5). De fant at forbehandling med adenosin eller en adenosinreseptoragonist induserte proteksjon mot infarkt i kaninhjerter på lik linje med iskemisk prekondisjonering. I tillegg kunne en adenosinreseptor-antagonist gitt før iskemisk prekondisjonering oppheve den beskyttende effekten. I tilsvarende farmakologiske studier har man også undersøkt betydningen av andre signalsubstanser og reseptorer. Man tenker seg at stimulering av intracellulære signalsystemer utløses av en ”trigger” som aktiverer en/flere ”mediator(er)”, som igjen aktiverer en/flere ”endeeffektor(er)” (5). En slik trinnvis aktivering gir store muligheter for intracellulær forsterkning av signalet, samt muligheter for interaksjon mellom ulike signalsystemer. Det er vist at farmakologiske forbindelser som aktiverer ulike trinn i disse systemene, kan etterlikne iskemisk prekondisjonering (tab 2). Det er naturlig å tenke seg at substanser som blir produsert i hjertet under iskemi (eventuelt også under reperfusjon) er medvirkende. Man mener at signalsubstanser som binder seg til inhibitoriske G-protein (Gi-)-koblede reseptorer (adenosin, bradykinin, adrenalin, opioidpeptider, acetylkolin) spiller en sentral rolle som slike triggere. I tillegg kan også andre substanser være involvert (nitrogenmonoksid, O ₂ -radikaler, kalsium, metabolske produkter (arakidonsyremetabolitter), angiotensin II, endotelin, kalsitoningenrelatert peptid, cytokiner) (5). I og med at prekondisjonering ser ut til å omfatte aktivering av flere intracellulære signalsystemer, kan det virke overraskende at det er mulig å indusere fullgod beskyttelse med forbehandling med en enkelt

farmakologisk forbindelse som sannsynligvis bare aktiverer én signalvei. Dette kan imidlertid forklares ved interaksjon mellom de ulike triggere og en hypotetisk grense for hvor kraftig et stimuli må være for å indusere en effektiv respons. Ved iskemisk prekondisjonering må summen av endogent produserte triggere være over denne grensen for å indusere beskyttelse (25). Ved farmakologisk prekondisjonering vil altså dosen av farmaka være avgjørende.

Kliniske aspekter ved prekondisjonering i hjertet

Det er sannsynlig at prekondisjonering også eksisterer i hjertet hos mennesker (37). I visse situasjoner kan fenomenet sannsynligvis forekomme ”naturlig” hos pasienter med koronarsykdom. ”Startangina” er et velkjent fenomen (38), og det ser ut til at angina før infarkt (”preinfarktangina”) kan redusere forekomsten av komplikasjoner og dødelighet i akuttfasen (39). Kliniske studier indikerer at iskemisk prekondisjonering kan induseres i forbindelse med perkutan transluminal koronar angioplastikk (PTCA) (40) og koronarkirurgi (41) og muligens redusere grad av celleskade (28). Det er imidlertid verdt å merke seg at koronarpasienter ofte har utbredt kollateralsirkulasjon. Det kan derfor være vanskelig å avgjøre om økt toleranse mot iskemi kommer av prekondisjonering eller er et resultat av rekrutterte kollateraler. Studier i isolerte humane preparater (atrie- og ventrikkeltrabekler) gir ytterligere indikasjon på at prekondisjonering eksisterer hos mennesket. Resultater fra studier i dyreeksperimentelle modeller (42, 43) samt studier ved elektiv PTCA hos mennesker (44, 45) indikerer at adenosinreseptorer, enzymet PKC og K _ATP -kanaler er involvert.

Terapeutisk vil det være ønskelig å kunne indusere prekondisjonering ved truende infarkt. Prekondisjonering kan også være aktuelt i kombinasjon med elektive revaskulariseringsprosedyrer som PTCA og koronarkirurgi. En gunstig effekt vil kunne utsette nekroseutvikling og forlenge tiden man har til rådighet ved teknisk vanskelige prosedyrer. Dette er særlig aktuelt hos høyrisikopasienter og ved inadekvat tilførsel av kardioplegi. Prekondisjonering indusert ved iskemi har begrenset potensial, fordi det også vil redusere kontraktil funksjon (stunning) og initialt redusere cellens energilagre. Farmakologisk prekondisjonering har større potensial, men brukes ikke rutinemessig hos pasienter i dag. Det er flere årsaker til dette. Flere sentrale spørsmål er fortsatt uavklart, blant annet hvorvidt slik prekondisjonering kan beskytte mot reversibel postiskemisk dysfunksjon (stunning) hos mennesker, samt om effekten er additiv til kardioplegi og konvensjonell antianginøs medikamentell behandling ( β -blokkere, glyseroltrinitrat, kalsiumantagonister). Noen kliniske studier har vist at adenosin gitt før koronarkirurgi kan være gunstig (46), men om denne effekten er additiv til kardioplegi er usikkert (47).

Det er heller ikke kjent om prekondisjonering påvirker arytmifrekvens hos mennesker. Eksperimentelle studier indikerer at effekten av prekondisjonering blir redusert ved høy alder, hjertesvikt og hyperkolesterolemi, men er bevart ved hypertensjon og tilstedeværelse av en koronarstenose. Ved peroral behandling av diabetes brukes ofte sulfonylurea, som blokkerer K _ATP -kanaler. Dette kan være uheldig fordi det kan redusere hjertets iskemitoleranse og motvirke effekten av prekondisjonering (48). Farmakologisk prekondisjonering er også forbundet med ytterligere utfordringer, idet aktuelle farmaka kan gi flere uønskede bivirkninger. Adenosin kan indusere hypotensjon og bradyarytmi, PKC-aktivatorer har muligens en karsinogen effekt, og K _ATP -kanalåpnere kan øke faren for arytmier.

Konklusjon og perspektiver

Prekondisjonering er en adaptiv respons på potensielt skadelige stimuli og involverer aktivering av endogene forsvarsmekanismer. Den cellulære basis for adaptasjonen er ikke klarlagt i detalj. Mange plausible hypoteser foreligger, og sannsynligvis er flere mekanismer involvert samtidig. Prekondisjonering gir kun en forsinket utvikling av celledød, men har stort klinisk potensial i dag fordi det finnes gode teknikker for revaskularisering ved truende hjerteinfarkt. I tillegg behandles stadig sykere pasienter elektivt, og disse trenger optimal myokardproteksjon. Fremtidig terapeutisk utnyttelse av prekondisjonering er avhengig av en bedre forståelse av de cellulære mekanismer som er involvert. Om mulig vil identifisering av en endeeffektor for den beskyttende effekten føre til at mer spesifikke farmaka utvikles. Kanskje kan man oppnå å indusere en vedvarende ”prekondisjonert tilstand” i myokard hos høyrisikopasienter. Fremtidig utnyttelse av prekondisjonering vil også avhenge av resultater fra forskningsaktivitet knyttet til andre behandlingsformer. Blant annet representerer genterapeutisk hemming av aterosklerose, stimulering av angiogenese, regulering av gentranskripsjon og stimulering av myocyttproliferasjon spennende alternativer.