Utformingen av genterapeutiske strategier er basert på de siste års store fremskritt i forståelsen av HIV-virusets genetikk, molekylærbiologi og patogenesen ved HIV-infeksjon (1). HIV-viruset har et RNA-genom. Virusets oppbygning er vist i figur 1. Den viktigste målcelle som angripes av HIV og etter hvert destrueres i organismen, er CD4-positive T-lymfocytter som spiller en sentral rolle i immunforsvaret. Etter at virus er trengt inn i cellen, blir arvestoffet i RNA-form ”oversatt” til DNA (ved hjelp av virusenzymet revers transkriptase) som så bygges inn i vertscellens DNA-genom (fig 2). Det integrerte virusgenomet styrer så syntesen av nye viruspartikler i cellen ved at det koder for tre sett av virusproteiner: strukturelle proteiner (Gag, Pol, og Env), regulatoriske proteiner (Tat, Rev, Nef) samt såkalte modningsproteiner (Vif, Vpu, Vpr). Tabell 1 viser HIV-1-virusets viktigste gener og genprodukter. Teoretisk kan man avbryte virusets livssyklus og replikasjon ved å blokkere eller hemme funksjonen for ett eller flere av de nevnte gener og deres korresponderende proteiner. Det finnes ikke noen god dyremodell for human HIV-infeksjon, og en vesentlig del av de prekliniske studier med genterapi er basert på in vitro-eksperimenter med cellekulturer. Basert først og fremst på slike eksperimenter, er flere av strategiene nevnt i tabell 2 allerede forsøkt i fase-I- og i noen få tilfeller også i fase-II-forsøk hos HIV-infiserte individer. I det følgende legges hovedvekten på de genterapistudier som allerede er eller har vært under klinisk prøving. De strategier som er under utprøvning i dag ved genterapi av HIV-infeksjon, faller i to hovedgrupper:
Intracellulær hemning av HIV
Genterapi som tar sikte på intracellulær hemning av HIV, kan enten være basert på interferens eller modulering av virale nukleinsyrer eller av virale eller cellulære proteiner (2, 3).
Terapi basert på virale nukleinsyrer . Disse terapiformene faller i to hovedgrupper:
– RNA-baserte strategier basert på antisens, ribozymer, eller ”decoys” (”lokkeduemolekyler”)
– Eksogent tilførte, syntetiske DNA-oligonukleotider med antisensegenskaper.
– Antisens. Ved antisensterapi introduseres et gen i målcellene som fører til ekspresjon av RNA-molekyler, komplementære til det virus-RNA man ønsker å angripe (4). Dette fører til spesifikk binding av det terapeutiske RNA til det virale målmolekylet, noe som gir blokkering av funksjon og/eller nedbrytning av dette molekylet (fig 3). Fase-I-studier hos HIV-pasienter er i dag i gang med antisensterapi rettet mot følgende viktige virale målmolekyler: den såkalte TAR-sekvensen; budbringer-RNA for rev-genet; pol-genet; viralt genom RNA (5).
Figur 3 Ved antisensterapi søker man å blokkere spesifikt funksjonen for virusets mRNA for et spesielt virusprotein. Dette oppnås ved at man introduserer et gen i målcellene, f.eks. CD4-positive T-lymfocytter, som fører til ekspresjon av RNA-molekyler, som er komplementære til det virus RNA man ønsker å angripe, og ved spesifikk binding til dette gir blokkering av funksjon og/eller nedbrytning av molekylet. Ribozymer har tilsvarende antisensfunksjon, men har i tillegg enzymatisk effekt slik at viralt mRNA destrueres raskt etter binding TAR-sekvensen er bindingsstedet for det sentrale regulatoriske virusproteinet Tat, som har stor betydning for tempoet i virusreplikasjonen i cellen (fig 2). Rev-proteinet binder en spesiell RNA-sekvens til RRE som er bredt representert på viralt budbringer-RNA og er vesentlig for danning av nye viruspartikler i cellen (1 ). Det foreligger ingen publiserte kliniske resultater så langt. Det er en rekke problemer med antisensstrategi (6 ). Det kreves relativt høye intracellulære konsentrasjoner av det uttrykte antisens-RNA for antiviral effekt. Dette problemet kan muligens løses ved bedret teknologi når det gjelder effektiviteten i genekspresjon. Et annet viktig problem som også er velkjent når det gjelder konvensjonell anti-HIV-terapi med medikamenter, er den store risiko for resistensutvikling i virusets arvestoff, noe som vil redusere eller oppheve effekten av det anvendte antisens-RNA. Antisensstrategi vil derfor etter all sannsynlighet ev. bli anvendt i kombinasjon med andre terapiformer, blant annet for å motvirke resistensutvikling.
– Ribozymer. Ribozymer er antisensmolekyler med enzymatisk effekt, slik at de etter binding til de virale RNA-molekyler som representerer målet, forårsaker ødeleggelse av disse. Ribozymmolekylene er så vidt små at flere ulike ribozymer med forskjellig angrepspunkt kan bygges inn i samme vektorsystem, samtidig som det er mulig å konstruere ribozymmolekyler som angriper på ulike steder i det virale RNA samtidig.
Ribozymer kan angripe viralt RNA både før og etter at virusets arvestoff er bygd inn i vertscellens kromosomale DNA (2, 3). Videre er det lovende foreløpige resultater av forsøk på å manipulere ribozymmolekylenes bygning slik at de kan styres mer direkte til de områder i den HIV-infiserte celle hvor deres mål-RNA finnes.
Flere fase-I-studier er i dag i gang med ribozymterapi, men resultater er foreløpig ikke publisert (7, 8). Et vesentlig problem også her er risikoen for at viruset skal utvikle mutanter resistente mot det anvendte ribozym. Også denne terapiformen vil derfor etter all sannsynlighet måtte anvendes i kombinasjonsopplegg.
– ”Decoys” (”lokkeduemolekyler”). Områdene TAR og RRE på viralt RNA representerer viktige bindingssteder for de sentrale regulatoriske virusproteinene, Tat og Rev, og denne bindingen kan blokkeres genterapeutisk ved ”decoy”-strategi. Denne er basert på innføring av et gen i vertscellene som uttrykker korte RNA-molekyler, som er strukturlike med virusets TAR og RRE (1 – 3). ”Decoy”-molekylene vil så binde de regulatoriske virusproteinene Tat og Rev (fig 4), og slik ”lokke” dem vekk fra TAR og RRE. I cellekulturer har dette prinsippet betydelig antiviral effekt. Det er imidlertid en viss bekymring for at denne formen for genterapi kan medføre potensielt alvorlige bivirkninger, siden den ”naturlige” bindingen mellom Tat og Rev på den ene siden, og deres korresponderende RNA på den annen, også involverer binding av vertscelleproteiner som derved kan avledes fra normale cellefunksjoner (6). Det arbeides for å konstruere ”decoy”-molekyler som ikke lenger binder slike celleproteiner. De første fase I-studiene er nå i gang med ”decoy”-strategi som beskrevet, men kliniske resultater foreligger ikke.
Figur 4 Prinsippet for genterapi basert på ”decoys” eller ”lokkeduemolekyler” hvor man søker å nøytralisere funksjonen av det viktige regulatoriske virusproteinet Tat som er vesentlig for effektiviteten i HIV-replikasjonen ved at Tat binder seg til TAR på virusets RNA. Denne bindingen blokkeres genterapeutisk ved innføring av et gen i målcellen som fører til uttrykk av korte RNA-molekyler, på figuren kalt TAR ”decoy”, som er strukturlike med virusets TAR. TAR ”decoy”-molekylene vil binde Tat og slik ”lokke” dem vekk fra TAR
– DNA-oligonukleotider. Også her dreier det seg om et antisensprinsipp idet utenfra tilførte oligonukleotider designes slik at de gir spesifikk binding til det virale budbringer-RNA som er målmolekylene (6). Dette blokkerer budbringer-RNA slik at det korresponderende virusproteinet ikke syntetiseres i cellen. Disse terapiformene har et meget stort potensial. De er effektive i cellekultureksperimenter, og har også vist seg å forsterke virkningen av konvensjonelle anti-HIV-medikamenter in vitro. Innledende fase I-eksperimenter med et slikt oligonukleotid (GEM 91) rettet mot budbringer-RNA for gag-genet i virusgenomet, er allerede publisert (9), og en forbedring av dette molekylet (GEM 92) vil trolig snarlig bli satt i klinisk prøving.
Terapi basert på intracellulære proteiner med anti-HIV-effekt . Som vist i tabell 2, er flere strategier aktuelle med sikte på å hemme funksjonen av virale eller cellulære proteiner i den infiserte celle (2, 3).
– Dominant negative proteiner. Man tar her sikte på å innføre gener eller genfragmenter som leder til syntese av proteiner nær beslektet med viktige virusproteiner, men uten visse essensielle egenskaper ved ”naturlig” virusprotein (5, 6, 10). Slike modifiserte proteiner vil ha antiviral virkning dels ved at de konkurrerer med det ”naturlige” virusprotein om bindingssteder på virus-RNA, dels ved at de beslaglegger cellulære faktorer som inngår i den ”naturlige” binding mellom virusprotein og virus-RNA, og endelig ved at de danner komplekser med det normalt forekommende virusproteinet og derved nøytraliserer dette (fig 5). En rekke virale proteiner er angrepet med denne strategien i cellekulturforsøk. Lengst i klinisk utnyttelse er man kommet med innføring av et gen som koder for et modifisert Rev-protein (Rev M10) og i hvert fall to kliniske fase-I-studier er i gang (10, 11). Kliniske resultater av denne strategien er ennå ikke publisert. Av betydelig interesse er det at man har klart å fremstille et protein som representerer en kombinasjon av endrede Tat- og Rev-proteiner. Innføring av gensekvensen for dette proteinet i dyrkede celler har en betydelig anti-HIV-effekt, og genet har derfor et klart potensial for genterapi (3, 6).
Figur 5 Prinsippet for genterapi basert på introduksjon i målcellen av et gen som genererer såkalt dominant negative proteiner, dvs. proteiner beslektet med viktige ”naturlige” virusproteiner. Figuren viser slik terapi rettet mot det viktige virusproteinet Rev. Innføring av gen for modifisert Rev, på figuren kalt ”Rev” fører til at funksjonen av virusets eget Rev nøytraliseres ved flere mekanismer, først og fremst ved kompleksdanning mellom ”Rev” og Rev og ved at de to molekyltypene konkurrerer om binding til RRE på virusets mRNA
Et mulig problem ved genterapi basert på dominante negative proteiner er at disse vertsfremmede proteinene kan tenkes å utløse et immunsvar når de uttrykkes i modifiserte vertsceller, som derved kan bli destruert, slik at den terapeutiske effekt oppheves.
– Cellulære proteiner. Innføring av gener som koder for cellulære proteiner, dvs. proteiner av vertsopprinnelse som har anti-HIV-effekt, kan også tenkes benyttet ved genterapi av HIV-infeksjon (6). CD4-molekylet uttrykkes på overflaten av CD4-positive lymfocytter og har evnen til å binde HIV. I cellekulturer er det vist at celler hvor man har introdusert genet for et modifisert CD4-molekyl som holdes tilbake i cellens cytoplasma, har en viss anti-HIV-effekt, men dette er foreløpig ikke forsøkt in vivo. Heller ikke introduksjonen av genet for humant alfa-2-interferon som i cellekulturer har en klar anti-HIV-effekt, har vært brakt videre i kliniske forsøk, delvis fordi muligheten av bivirkninger med denne strategien er til stede. Også introduksjon av genet for betainterferon har gitt interessante resultater i kulturer av celler både fra HIV-pasienter og fra normale individer. Man kan på denne måten oppnå en vedvarende lav produksjon av betainterferon som har en klar HIV-effekt og i tillegg bedrer cellenes immunologiske funksjon. Kliniske forsøk er ennå ikke publisert med denne strategien.
– ”Intrabodies”. Det lar seg gjøre å innføre et gen i vertsceller, blant annet CD4-lymfocytter, som gir syntese av såkalte ”intrabodies”, dvs. antigenbindende enkeltkjedefragmenter avledet av ordinære antistoffmolekyler (fig 6). Slike ”intrabodies” som kan konstrueres slik at de reagerer selektivt med essensielle HIV-proteiner, kan hemme virusreplikasjon i cellekulturer (3, 6). De første fase-I-forsøk hos HIV-pasienter er allerede i gang med genterapi basert på ”intrabodies” mot Rev-proteinet og mot HIV-1 gp 120 (Env). Ingen kliniske resultater er kjent ennå.
Figur 6 Prinsippet for genterapi basert på introduksjon i målcellen av et gen som gir syntese av ”intrabodies”, dvs. antigenbindende enkeltkjedefragmenter avledet av ordinære antistoffmolekyler. Slike ”intrabodies” kan konstrueres slik at de reagerer spesifikt med essensielle HIV-proteiner og hemmer deres funksjon og dermed virusreplikasjonen
– Selvmordsgener. I cellekulturer har det latt seg gjøre å innføre flere forskjellige selvmordsgener som direkte eller indirekte fører til cellens død, hvis den blir infisert med HIV. Dette kan gjøres for eksempel ved innføring av gen for difteritoksin, og ved innføring av tymidinkinasegenet fra herpes simplex-virus, som medfører celledød hvis cellene utsettes for virusmedikamentet ganciklovir (3, 6). Kliniske forsøk med denne strategien er ennå ikke utført.
Problemer ved genterapi av HIV-infeksjon
I tillegg til de angrepspunkter man hittil har fokusert på, kan genterapi også rettes mot andre viktige prosesser i HIV-infeksjonens livssyklus og immunpatogenese. Imidlertid er det en rekke problemer som må løses før genterapi vil være et aktuelt behandlingstilbud ved HIV-infeksjon (3, 6). Mange av disse problemene er generelle for genterapi i dag, mens andre er knyttet til HIV-infeksjonens kompleksitet i seg selv. De målceller som hittil har vært aktuelle ved både cellekulturstudier og i kliniske forsøk, er CD4-T-lymfocytter og CD8-T-lymfocytter; de første fordi de representerer virusets viktigste angrepspunkt, de siste fordi de ansees viktige i immunforsvaret mot HIV. Imidlertid er dette neppe ideelle målceller, siden både CD4- og CD8-lymfocytters levetid i organismen er begrenset, og genetisk modifikasjon av disse cellene neppe vil føre til en økning ved celledeling av tilsvarende genmodifiserte celler i organismen. Videre er de genoverføringssystemer som hittil har vært anvendt, lite effektive overfor disse celletypene. Endelig finnes den alt overveiende mengde CD4-lymfocytter ikke i perifere blodbaner, men i lymfoid vev hvor det også er store mengder virus, og bare en liten proporsjon av pasientens CD4-lymfocytter kan derfor modifiseres genetisk på denne måten.
Ved HIV-infeksjon vil det være langt mer attraktivt å benytte hematopoetiske stamceller som målceller i stedet for T-lymfocytter. Eventuelt genetisk modifiserte stamceller ville i prinsippet gi opphav til et stort antall datterceller med samme gen, slik at en betydelig del av pasientens immunsystem vil bli repopulert med modifiserte celler. Forsøk har allerede vist at det lar seg gjøre å utvinne et betydelig antall CD34-positive stamceller fra perifert blod og navlestrengsblod hos HIV-pasienter (12). De overføringssystemer som hittil har vært benyttet ved genterapi, er lite effektive overfor CD34-positive stamceller, men nye resultater tyder på at lentivirusvektorer kan gi tilfredsstillende resultater. Sikkerhet ved bruk av lentivirus ved genoverføring er imidlertid ufullstendig klarlagt.
Helt vesentlige problemer er knyttet til HIV-virusets store heterogenitet, idet et stort antall virusvarianter allerede er til stede hos den enkelte HIV-pasient, og disse kan teoretisk reagere ulikt på den enkelte genterapeutiske strategi. Enda mer problematisk er virusets store evne til mutasjoner som kan føre til utvikling av resistens mot den i det enkelte tilfelle anvendte genterapeutiske strategi. Også ”privilegerte” lokalisasjoner av viruset i organismen, for eksempel i sentralnervesystemet, hvor den aktuelle terapi ikke når frem, er et betydelig problem ved så vel genterapi som ved konvensjonell medikamentell behandling. Alle disse forhold gjør at genterapi i fremtiden sannsynligvis vil bli kombinert med andre behandlingsformer inkludert medikamentell terapi.
