Omarbeidet prøveforelesning for den medisinske doktorgrad, Det medisinske fakultet, Universitetet i Tromsø, 1998
Kreftsykdommene dreper halvparten av sine ofre (1). De fleste dødsfallene skyldes lokale residiv eller ekspansjon av metastaser som er utilgjengelige for kirurgi og resistente mot bestråling og cytostatika. Disse behandlingsformenes utilstrekkelighet innebærer at nye terapeutiske prinsipper må utvikles, rettet mot cancerceller som gjenstår etter konvensjonell tumorreduktiv terapi. Mobilisering av pasientens immunsystem representerer en attraktiv mulighet, av flere grunner:
Immunresponsen er spesifikk , idet den effektivt skiller individets egne molekyler fra fremmede selv ved høy grad av strukturlikhet. Eksempelvis erfarte man i diabetikerbehandlingen at antistoffer produsert etter substitusjon med svineinsulin ikke kryssreagerte med humant insulin, på tross av at de to variantene er identiske i 98 % av aminosyreposisjonene. I skarp kontrast til dette står den ufullstendige diskriminering mellom normalt og patologisk vev som er et hovedproblem ved konvensjonell kreftbehandling: Risikoen for uopprettelig å skade friske organer er dosebegrensende for cellegifter så vel som for ioniserende stråling.
Immunresponsen er sensitiv . Cytotoksiske T-lymfocytter kan detektere selv ett enkelt antigenmolekyl på overflaten av en målcelle, som dermed blinkes ut for drap (2).
Immunsystemet har varig hukommelse , hvilket innebærer at forsvarsresponsen er kraftigere og inntrer raskere ved gjentatt eksposisjon selv mange tiår etter det første møtet med antigenet. Hvordan dette medfører langvarig, effektiv beskyttelse er godtgjort av kong Christian VIIIs sendemann til Færøyene, hvor en meslingepidemi i 1781 hadde desimert befolkningen. Da et skip i 1846 på ny brakte smitten til øygruppen, ble ingen over 64 år rammet (3) – de var immune etter å ha gjennomgått infeksjonen i tidlige barneår.
Lymfocyttrepertoarets størrelse innebærer evne til å mobilisere en spesifikk immunrespons mot nærmest ethvert makromolekyl, idet det enkelte individ besitter minimum flere titalls millioner lymfocyttkloner som hver uttrykker en unik antigenreseptor (4). Repertoaret er i praksis bare begrenset av barrieren mot autoimmunitet: Toleransemekanismer eliminerer umodne T- og B-lymfocytter som bærer antigenreseptorer med affinitet for kroppsegne molekyler.
Immunsystemet har stor slagkraft mot celler som er genetisk fremmede, jevnfør den fullstendige vevsødeleggelse som er fullbyrdet kort tid etter transplantasjon til en ikke-immunsupprimert mottaker.
I likhet med et allotransplantat består en kreftsvulst av celler som for vertsorganismen er genetisk fremmede, idet mutasjoner både er en nødvendig forutsetning for og en typisk følge av malign transformasjon. Til forskjell fra normale genprodukter, som induserer toleranse via eliminasjon av forbudte lymfocyttkloner i beinmarg og thymus, uttrykkes proteiner kodet av muterte tumorgener først etter at modne, immunkompetente lymfocytter har inntatt perifere lymfoide organer. Gitt det enorme lymfocyttrepertoaret inneholder disse derfor kloner med antigenreseptorer rettet mot tumorproteiner. Terapeutisk immunisering med tumorspesifikke proteinsekvenser sikter mot å aktivere kreftpasientens tumorreaktive lymfocytter. Målet er å oppnå selektiv og komplett utryddelse av kreftceller etterlatt av konvensjonell behandling, mens friskt vev bevares uskadet og hukommelsesceller utvikles som en livslang barriere mot residiv.
Aktivering av tumorspesifikke T-hjelpelymfocytter
En optimal antitumorrespons krever etter alt å dømme aktivering av CD4-positive T-lymfocytter (T-hjelpeceller), da disse dirigerer alle immunsvar rettet mot proteinantigener og fremmer humorale så vel som cellulære effektorfunksjoner ved å stimulere makrofager, B-lymfocytter og CD8-positive cytotoksiske T-celler. Tumorinfiltrerende T-hjelpeceller gjenkjenner unike tumorantigener i maligne melanomer (5), B-cellelymfomer (6) samt karsinomer utgående fra mamma (7), colon (8) og ovarium (9). T-lymfocytter aktiveres initialt i lymfeknuter og andre perifere lymfoide organer. At kreftsvulster utvikler seg på tross av en viss spontan T-celleaktivering, kan skyldes at utilstrekkelige mengder tumorantigen når lymfeknutene før svulsten ekspanderer utover immunresponsens rekkevidde. Følgende strategi for utvikling av kreftvaksiner peker seg ut:
– Tumorspesifikke antigener må identifiseres og renfremstilles.
– Vaksinen må inneholde komponenter som aktiverer T-hjelpeceller.
– Immunisering må forutgås av maksimal konvensjonell tumorreduksjon.
T-hjelpeceller medierer tumordrap
T-hjelpecelleaktivering starter med at en klonalt distribuert reseptor engasjerer peptidfragmenter av antigenet i kompleks med HLA-klasse II (HLA-DP, -DQ og -DR)-molekyler på overflaten av en antigenpresenterende celle (10). T-hjelpeceller kan derfor ikke direkte angripe tumorer som ikke uttrykker HLA-klasse II-molekyler, men kan indirekte mediere tumordrap ved å stimulere cytotoksiske CD8-positive T-lymfocytter og makrofager. Stilt overfor HLA-klasse II-bærende svulster vil T-hjelpecellene selv kunne ha eksekutørens rolle (11) (fig 1): Etter at antigenreseptor har bundet peptid/HLA-klasse II-kompleks, induseres tumorapoptose ved at T-cellens Fas ligand engasjerer kreftcellens Fas. Alternativt kan T-hjelpeceller lysere maligne tumorer ved å frigjøre det komplementliknende proteinet perforin, som ødelegger målcellens plasmamembran (12). Mens HLA-klasse I finnes på de fleste kjerneholdige celler, er klasse II-ekspresjon normalt begrenset til hovedsakelig lymfocytter, dendrittiske celler og makrofager. Med hensyn til T-hjelpecellemediert cytotoksisitet er det derfor vesentlig at mange karsinomer uttrykker HLA-klasse II (13, 14, tab 1 (13 – 15)), selv om de utgår fra klasse II-negativt epitel. Dette åpner for at terapeutisk immunisering kan mobilisere cytotoksiske T-hjelpeceller mot flere hyppig forekommende krefttyper. Man er nå i ferd med å vinne klinisk erfaring med dette behandlingsprinsippet, idet en rekke tumorantigener som presenteres for T-hjelpeceller, som peptid/HLA-klasse II-komplekser, nylig er identifisert og definert på molekylært nivå.
Figur 1 Stilt overfor en HLA-klasse II-positiv kreftcelle kan T-hjelpelymfocytter som gjenkjenner tumorantigenpeptid/klasse II-komplekser lysere kreftcellen ved å frigjøre perforin, som ødelegger plasmamembranen, og indusere apoptose (programmert celledød) via interaksjon mellom Fas ligand og Fas. Dersom tumor også uttrykker HLA-klasse I, kan angrepet forsterkes ytterligere ved at cytokiner fra aktiverte T-hjelpelymfocytter stimulerer CD8-positive cytotoksiske T-celler. CD8-positive T-celler har reseptor for peptid/klasse I-komplekser og råder over et cytotoksisk armamentarium som inkluderer perforin, Fas ligand og granzymer (proteaser). Via slik parakrin stimulering av CD8-positive T-celler (mediert av lokalt virkende cytokiner, bl.a. interleukin-2) kan T-hjelpeceller bidra til drap også av klasse II-negative tumorer
Tabell 1 HLA-klasse II-ekspresjon i maligne svulster (13 – 15)
Vev
Tumor
Andel pasienter med tumor som uttrykker HLA-DR (%)
Bryst
Duktalt karsinom
21
Lobulært karsinom
26
Hud
Malignt melanom
25
Livmorhals
Adenokarsinom
90
Plateepitelkarsinom
83
Lunger
Bronkialcancer, samlet
18
Magesekk
Adenokarsinom
53
Strupe
Plateepitelkarsinom
12
Tykktarm
Adenokarsinom
32
Mucinøst karsinom
63
Tumorantigener som presenteres for T-hjelpelymfocytter
Mutert p21 ras
Mutasjoner i p21 ras-protoonkogenet medfører at proliferasjonsfremmende signaler vedvarende formidles til cellekjernen, og mutasjonene bidrar slik til malign transformasjon (16). Hvert år får 2 100 – 2 900 nordmenn en kreftsvulst som uttrykker én blant et høyst begrenset antall punktmutasjoner i dette genet (1, 17 – 22), idet enkeltstående nukleotidsubstitusjoner i kodon 12, 13 eller 61 finnes i 90 % av pancreasadenokarsinomer (17), i 60 % av follikulære thyreoideakarsinomer (18), i 39 – 65 % av kolorektale adenokarsinomer (19), i 50 % av gallegangskarsinomer (20), i 30 % av bronkiale adenokarsinomer (21) og i 20 % av maligne melanomer (22). Peptider fra mutert p21 ras presenteres av en rekke HLA-klasse II-varianter og stimulerer T-hjelpelymfocytter fra kreftpasienter (23, 24). Ansporet av disse funn har norske forskere oppnådd aktivering av spesifikke, cytotoksiske T-hjelpeceller ved å immunisere pancreascancerpasienter med mutert p21 ras-peptid (25).
p210BCR-ABL fusjonsprotein
80 – 90 % av kroniske myelogene leukemier bærer Philadelphia-kromosomet, som dannes ved utveksling av DNA mellom kromosomene 9 og 22 (26). Denne genetiske rearrangeringen resulterer i et nytt gen ved at c-ABL-protoonkogenet fra kromosom 9 bringes inntil BCR-genet ved bruddstedet i kromosom 22. I naboposisjon transkriberes ABL og BCR som ett funksjonelt gen, som uttrykkes i form av et fusjonsprotein, p210BCR-ABL . Dette har abnorm tyrosinkinaseaktivitet og interfererer med signalveier som regulerer celledeling (27). Bruddstedpeptidet, som representerer den aminosyresekvens som fremkommer ved sammenføyning av de to genelementene, er en tumorspesifikk struktur. Dette har potensial i vaksinasjonsøyemed, idet leukemiske blaster gjenkjennes av HLA-DR4-restrikte T-hjelpeceller drevet frem ved immunisering med bruddstedpeptidet in vitro (28). Immunologisk toleranse er ikke til hinder for denne responsen: Mens sensuren i thymus eliminerer kloner som gjenkjenner henholdsvis BCR- og ABL-genproduktene, etableres ikke toleranse for sammenføyningsstedet i p210BCR-ABL fordi fusjonsproteinet først oppstår etter at et komplett T-lymfocyttrepertoar er modnet.
Tyrosinase
T-hjelpeceller som inntar maligne melanomer, responderer mot peptider fra tyrosinase (5), et enzym som er involvert i melaninsyntesen og uttrykt utelukkende i melanocytter. Noe overraskende er tyrosinasegenet ikke mutert, altså er melanominfiltrerende T-hjelpeceller spesifikt rettet mot et normalt, kroppseget protein. Fravær av toleranse tilskrives den vevsspesifikke ekspresjonen, som hindrer at T-lymfocytter møter tyrosinasepeptider mens de fremdeles er i thymus og følsomme for toleranseinduksjon. Normale melanocytter unngår angrep fra T-hjelpeceller fordi de ikke uttrykker HLA-klasse II. 25 % av maligne melanomer, derimot, bærer HLA-klasse II-molekyler (15) og er dermed mulige mål for tyrosinasespesifikke T-hjelpeceller. Noen melanompasienter utvikler vitiligo i forløpet av immunterapi (29). Dette illustrerer at immunresponsen retter seg mot antigener som er felles for melanomceller og normale melanocytter, og viser at brudd på toleransen for normalt vev kan være en bivirkning ved immunologisk behandling.
HER-2/neu
Maligne cellers ukontrollerte proliferasjon er ofte assosiert med aberrant aktivering av gener som er involvert i cellevekstregulering. HER-2/neu-genet antas å tilhøre denne kategorien, da det koder for et protein som har likhetstrekk med epidermal vekstfaktor-reseptor (30) og er overuttrykt i mange adenokarsinomer, bl.a. 30 % av maligne mamma- og ovarialtumorer (31). Hos brystkreftpasienter forekommer T-hjelpeceller så vel som antistoffer spesifikt rettet mot onkoproteinet HER-2/neu (32). Dette synes paradoksalt, på bakgrunn av at HER-2/neu-genet, i likhet med genet for tyrosinase, ikke er mutert. Forklaringen på at genproduktet ikke induserer toleranse er sannsynligvis den beskjedne mengden som produseres etter at lymfocyttmodningen begynner å skyte fart.
Cancerassosiert ekspresjon, presentasjon i form av peptid/HLA-klasse II-komplekser og fravær av toleranse gjør HER-2/neu til et mulig mål for T-hjelpecellebasert aktiv immunisering (33). Også passiv immunisering er aktuelt: Et monoklonalt antistoff (trastuzumab) mot HER-2/neu ble godkjent av Food and Drug Administration i 1998 og har siden vært et etablert behandlingstilbud for amerikanske kvinner med metastaserende mammacancer (34).
Immunglobulin
Immunglobulin er et tumorspesifikt antigen på B-celleneoplasmer, idet B-lymfocytters variable immunglobulindomener konstituerer en unik, klonotypisk antigenprofil (”idiotype”) (35). Dyreforsøk har vist at B-cellelymfomer presenterer sitt klonotypiske immunglobulin i form av peptid/H-2 (tilsvarer HLA) klasse II-komplekser (36) og dermed kan gjenkjennes av idiotypespesifikke T-hjelpeceller som effektivt angriper tumorcellene (37). Immunglobuliner har altså ikke alltid rollen som immunresponsens våpen, men kan selv være skyteskive. Dette utnyttes nå klinisk. Ved hjelp av hybridomteknologi produseres tumors immunglobulinvariant med utgangspunkt i maligne B-celler fra biopsier. Immunisering med konjugater av renset tumorimmunglobulin og det sterkt immunogene fremmedproteinet hemocyanin etter avsluttet kjemoterapi resulterte i spesifikk immunrespons hos 20 og komplett tumorregresjon hos to av 41 pasienter med follikulært, lavgradig non-Hodgkins lymfom (38). Perioden uten tumorprogrediering var i respondergruppen 7,9 år (median), men bare 1,3 år blant ikke-respondere. Randomiserte, prospektive studier er imidlertid nødvendig for å avklare verdien av slik behandling. Formodentlig kan metoden forbedres ved å kombinere T-hjelpecellerettede vaksiner med administrasjon av spesifikke antistoffer, idet våre studier viser at antistoffer mot immunglobulin induserer kraftig økt ekspresjon av immunglobulinpeptid/klasse II-komplekser på lymfomcelleoverflaten (39).
Kombinasjon av HLA-klasse I- og -II-bindende vaksinekomponenter
De T-hjelpecelledefinerte tumorantigenene HER-2/neu, tyrosinase, mutert p21 ras, p210BCR-ABL og immunglobulin er utførlig karakterisert på molekylært nivå (5, 23, 24, 28, 32, 40). Også CD8-positive cytotoksiske T-lymfocytter, som gjenkjenner tumorantigenpeptider i kompleks med HLA-klasse I, er vist å respondere mot disse antigenene: Mutert p21 ras presenteres av HLA-A2 (41), -B12 (42) og -B35 (43), tyrosinase av HLA-A2 (44), -A24 (45), -B35 (46) og -B44 (47), p210BCR-ABL av HLA-A3, -A11 og -B8 (48), HER-2/neu på HLA-A2 (49) og immunglobulin på den murine analog til HLA-B (50). Vaksiner satt sammen av både HLA-klasse I- og -klasse II-bindende peptider og derfor aktiverer både CD4- og CD8-positive T-lymfocytter, trer dermed frem som en attraktiv mulighet, idet interaksjoner mellom disse celletypene er grunnlag for et optimalt cellulært immunangrep.
Utfordringer ved utvikling av peptidvaksiner
En hemsko for utnyttelse av peptider som vaksine er den betydelige HLA-polymorfismen. Til de 314 kjente allele gener for HLA-klasse II svarer det samme antall varianter av klasse II-proteiner med unike peptidbindingsegenskaper. Peptider som kan binde en gitt HLA-variant, har visse strukturelle fellestrekk – motiver – typisk representert ved en sekvens som spenner over ni aminosyreposisjoner (10). Ulike peptidbindingsmotiver kan være delvis overlappende, og mange antigene tumorpeptider presenteres av flere ulike HLA-klasse II-varianter (eksempelvis presenteres p21 ras-peptid med mutasjonen glycinÆarginin i posisjon 12 på så vidt ulike klasse II-molekyler som HLA-DP3, -DQ7 og -DR2 (51)). Likevel vil et tumorderivert peptid som hos én pasient effektivt presenteres for T-hjelpeceller, hos en annen kunne mangle immunogenisitet fordi peptidet ikke går i kompleks med dennes HLA-varianter. Den raskt voksende kunnskap om de ulike HLA-varianters peptidbindingsmotiver åpner for at dette problemet kan angripes med peptidsyntesestrategier som sikter mot å øke affiniteten mellom HLA-molekyl og peptid. På dette vis lyktes man ved hjelp av en enkeltstående aminosyresubstitusjon å bedre affiniteten mellom tyrosinasepeptidet 448 – 462 og HLA-DR4 slik at antigenisiteten økte nær 1 000 ganger (52). Resultater fra eget laboratorium viser at man kan øke et peptids affinitet for HLA-klasse II betydelig også ved modifikasjoner utenfor den ni aminosyrer lange sekvensen som bestemmer allelisk spesifisitet, idet en forlengelse med én aminosyre tre posisjoner N-terminalt for selve motivsekvensen medførte en 15-folds økning av affiniteten mellom et immunglobulinpeptid og HLA-DR1 (53).
Peptider er sårbare for enzymatisk nedbrytning. Effektiv beskyttelse mot proteaser vil derfor øke peptiders anvendelighet som vaksiner. Proteolytisk resistens kan oppnås ved å erstatte de naturlige (L-)aminosyrene med korresponderende stereoisomere D-aminosyrer (inverso-modifikasjon), da proteolytiske enzymer spesifikt angriper L-aminosyrer. Imidlertid eliminerer inverso-modifikasjonen den biologiske aktivitet ved å endre orienteringen til aminosyrenes sidekjeder. De funksjonelle egenskapene til det naturlige peptidet kan likevel etterliknes ved samtidig å reversere peptidbindingene (retro-modifikasjon; -COCHRNH- istedenfor -NHCHRCO-) (54). I eksperimenter basert på immunglobulinspesifikke T-hjelpeceller fant vi at en retro-inverso-analog av immunglobulinpeptidet i høye konsentrasjoner frembrakte maksimal cytokinproduksjon (55). Også B-lymfocytter og cytotoksiske CD8-positive T-celler er vist å respondere mot retro-inverso-modifiserte antigenanaloger (56, 57). Dette åpner for at denne typen pseudopeptider kan finne universell anvendelse som vaksiner.
Immunologisk kreftbehandling – fra anekdotisk suksess til rasjonell peptidsyntese
Et hundreår er gått siden William Coley helbredet sarkompasienter ved inokulering av patogene streptokokker og dermed frembrakte holdepunkter for at immunaktivering har et terapeutisk potensial ved kreft (58). Coleys empiriske tilnærming er i den molekylærbiologiske æra erstattet med systematisk utprøvning av rasjonelt syntetiserte kreftvaksiner basert på ny viten innenfor immunologi, tumorgenetikk og peptidkjemi. Blant de fundamentale observasjoner er at HLA-klasse II-restrikte T-hjelpelymfocytter kan drepe kreftceller og at peptider derivert fra de strukturelt veldefinerte tumorantigenene HER-2/neu, tyrosinase, mutert p21 ras, p210BCR-ABL og immunglobulin presenteres effektivt på HLA-klasse II-molekyler. Ett eller flere av disse antigenene er uttrykt hos ca. 5 000 av dem som årlig diagnostiseres med kreftsykdom i Norge (1, 15, 17 – 22, 26, 32). Potensielle terapeutiske immunogener vil raskt kunne bli identifisert hos den enkelte pasient ved hjelp av screening – komplett genetisk karakterisering av den enkelte tumor er ikke nødvendig fordi de nevnte tumorpeptidene enten representerer et begrenset antall typiske mutasjoner (punktmutasjoner i K-ras er begrenset til tre kodoner, BCR og ABL fuserer på ett av to steder), lett isolerbare klonale varianter (immunglobulin) eller er produkt av ikke-muterte gener (tyrosinase, HER-2/neu). Den stadig økende kunnskap om HLA-molekylenes peptidbindingsmotiver muliggjør fremstilling av peptidvaksiner tilpasset pasientens HLA-varianter, med økt immunogenisitet som følge, og retro-inverso synteseteknologi kan utnyttes for å tilføre peptider proteolytisk resistens.
