Basert på tidligere publiserte/aksepterte originalarbeider (20, 21, 39, 40)
Kreft i munnhulen (fremre to tredeler av tunge, munnhulens gulv, harde gane, tannkjøtt og kinnslimhinne) rammer om lag 250 personer årlig i Norge, og forekomsten øker, også i yngre aldersgrupper (1). Til tross for omfattende forskning for å forbedre behandling av pasienter med kreft i hode- og halsområdet er femårs overlevelsesrate for denne pasientgruppen ikke vesentlig bedret de siste 50 årene (1 – 6). Tidligere diagnostikk og behandling er et av de få aktuelle alternativene for å redusere sykelighet og dødelighet av denne kreftformen.
De dominerende risikofaktorene for munnhulekreft er tobakk og alkohol. De fleste som har utviklet plateepitelkarsinomer i munnhulen, har vært eksponert for en eller begge risikofaktorer (7). Likevel er det bare en liten del av personer med slik risikoatferd som får plateepitelkarsinomer i hode- og halsområdet (8, 9). Fordi man ikke har hatt gode nok metoder til å identifisere pasienter med særlig høy risiko for utvikling av kreft fra premaligne lesjoner har man valgt å observere disse pasientene og behandle aktivt med kirurgi og strålebehandling kun de pasienter som har fått manifeste karsinomer. Ofte er dette for sent, fordi pasientene presenterer seg med avanserte (stadium 3 – 4) lesjoner (5, 10). Femårsoverlevelsen av selv begrenset sykdom (stadium 1 – 2) er i enkelte undersøkelser angitt å være så lav som 50 % (11).
Så å si alle plateepitelkarsinomer i munnhulen er forutgått av lett synlige hvite eller røde flekker i munnslimhinnen, noe som gir muligheten til identifisere og behandle lesjoner før de har utviklet seg til karsinomer (12 – 15). 5 – 15 % av hvite flekker i munnhulen og opptil 90 % av de røde flekkene vil utvikles til kreft (16 – 19). Det er derfor grunn til å være oppmerksom på det maligne potensialet til disse lesjonene. Effektiv forebyggende behandling har vært vanskelig å gi, fordi man ikke har hatt noen gode metoder til å identifisere de pasienter som har særlig høy risiko for utvikling av kreft fra hvite flekker. Vi har nylig undersøkt den prognostiske verdien av å identifisere DNA-innhold og grove genomiske avvik (DNA-aneuploiditet) i epitelceller fra hvite (leukoplakier) og røde (erytroplakier) flekker i munnhulen (20, 21). Felles for alle pasientene inkludert i disse undersøkelsene har vært at de ikke har hatt samtidig eller forutgående kreft, verken i hode- og halsområdet eller i andre lokalisasjoner. Alle pasienten hadde lesjoner som var blitt undersøkt histologisk, og ingen av pasientene hadde karsinomer eller carcinoma in situ. I denne oversiktsartikkelen presenterer vi et sammendrag av prognostiske undersøkelser hos pasienter med røde og hvite slimhinneforandringer i munnhulen, og diskuterer mulige behandlingsalternativer for pasienter med munnhulelesjoner som med stor sannsynlighet vil utvikles til kreft.
Grove genomiske avvik
Omfattende vitenskapelig dokumentasjon peker nå mot grove genomiske avvik (DNA-aneuploiditet) som en årsak til, snarere enn en konsekvens av kreftutvikling (22 – 24), også for kreft i hode- og halsområdet (25 – 27). Det molekylærbiologiske substratet for DNA-aneuploiditet er oftest ubalansert fordeling av kromosomer til datterceller. Dette kan igjen skyldes geniske mutasjoner (punktmutasjoner) i gener som koder for proteiner som styrer mitosen er vist å gi aneuploiditet (28). Andre strukturforandringer i genomet som kan gi DNA-aneuploiditet er kromosomale mutasjoner (for eksempel delesjoner, translokasjoner eller amplifikasjoner) eller genomiske mutasjoner (forandringer og avvik i antall kromosomer). Slike forandringer kan i sin tur kan føre til nye geniske, kromosomale eller genomiske mutasjoner. Resultatet kan bli endret metabolisme i cellene med neoplastisk vekst som følge (29, 30). Grove genomiske avvik er ofte tidlig forekommende i forløpet av en malign transformasjon (31) og kan derfor være en tidlig markør for kreftutvikling (32).
Metode for analyse av grove genomiske avvik (DNA-ploiditetsanalyse)
Parafininnstøpte blokker med vevsbiter ble snittet i tykke snitt (50 µ m) før enzymatisk bearbeiding (type XXIV-protease, Sigma Chemical, St. Louis) for fremstilling av isolerte cellekjerner. Hematoksylin- og eosinfargede snitt ble fremstilt før og etter snitting av tykke snitt for å få bekreftet innholdet av dysplastisk materiale i de tykke snittene.
DNA-innhold i cellekjerner ble målt ved transmisjonsmikroskopi av Feulgen-Schiff-fargede cellekjerner (33), med Fairfield bildeanalysesystem (Fairfield Imaging Systems, Tunbridge Wells, Storbritannia). Fortolkningene av DNA-ploiditets-distribusjonshistogrammer ble foretatt i henhold til en etablert protokoll (34). Fremstilling av isolerte cellekjerner fulgte en standardisert prosedyre, etablert ved Det Norske Radiumhospital (fig 1) (33, 35).
Figur 1 Parafininnstøpte blokker av biopsimateriale ble snittet og farget med hematoksylin og eosin for å få bekreftet innholdet av dysplasier. Snittene ble deparafinisert og rehydrert før enzymatisk nedbrytning til en suspensjon av cellekjerner. Suspensjonen ble sentrifugert, og cellekjerner ble deretter resuspendert og påført på et objektglass. Etter innfarging med Feulgen-Schiff-farge ble kjernene fotografert av et digitalt kamera montert på et mikroskop, og minst 300 kjerner fra hver pasient ble analysert. Lymfocytter ble brukt som internkontroll. Feulgen-Schiff-fargen binder seg til DNA i en mengde som er proporsjonal med DNA-mengden i kjernene, og et digitalt kamera registrerer hvor mye lys som slipper gjennom cellekjernene, som et mål på deres DNA-innhold. Den endelige DNA-ploiditetsklassifikasjon gjøres fra det DNA-ploiditetsdistribusjonshistogrammet som genereres. Langs den vertikale aksen i histogrammet vises antall epitelcellekjerner, mens den horisontale aksen viser DNA-mengden i hver cellekjerne. Figuren er omarbeidet etter Sudbø og medarbeidere (20 ) og er gjengitt med tillatelse fra Massachusetts Medical Society
Grupper av analyserte munnhulelesjoner
Leukoplakier med innhold av dysplasi
Vi identifiserte 242 pasienter med orale leukoplakier, hvorav biopsier fra 196 pasienter var blitt histologisk klassifisert som dysplastiske. Diagnosen dysplasi ble bekreftet av fire uavhengige patologer, som i tillegg graderte dysplasiene histologisk i henhold til retningslinjer gitt av WHO (36, 37). Lesjoner fra 150 av de 196 pasientene var tilgjengelige for måling av DNA-ploiditet. Eksempler på DNA-dysplastiske biopsier og de korresponderende DNA-ploiditets-distribusjonshistogrammer er vist i figur 2. Ved sammenlikning av DNA-ploiditetsklassifikasjon og den tradisjonelt anvendte histologisk gradering som prognostisk verktøy, fant man at DNA-ploiditetsklassifikasjon hadde betydelig prognostisk verdi (fig 3a), mens den histologiske graderingen ikke hadde statistisk signifikant verdi (fig 3b) (20).
Figur 2 DNA-ploiditetsdistribusjonshistogrammer (innfelt) og histologiske funn hos to pasienter med moderat dysplasi (A og B) og en pasient med mild dysplasi (C). Hematoksylin og eosin, ⋅ 400. I hvert histogram angir c antall kopier av homologe kromosomer. Figuren er omarbeidet etter Sudbø og medarbeidere (20 ), og er gjengitt med tillatelse fra Massachusetts Medical Society
Figur 3 Kaplan-Meier-kurver for kumulativ sykdomsfri overlevelse angitt i måneder etter tidspunkt for diagnose av dysplasi i leukoplakier. A. Etter klassifikasjon i henhold til DNA-innhold (ploiditet). B. I henhold til histologisk gradering av dysplasier. Legg merke til at de milde og moderate dysplasiene ser ut til å ha dårligere prognose enn de grove dysplasiene i dette datasettet. Figuren er omarbeidet etter Sudbø og medarbeidere (20 ), og gjengitt med tillatelse av Massachusetts Medical Society
Leukoplakier uten innhold av dysplasi
Hos 46 pasienter forelå det biopsier som opprinnelig var blitt klassifisert som dysplastiske, men som ved etterprøving av diagnosen ble funnet å være ikke-dysplastiske (akantose, hyperplasi, kronisk inflammasjon, lichen ruber planus) (21). Hos en pasient var det uenighet om hvilket organ lesjonen kom fra, og denne pasienten ble derfor utelatt fra analysen.
Fem av de gjenværende 45 pasientene, som i utgangspunktet hadde lesjoner man ikke ville mistenkt for å være premaligne, hadde DNA-aneuploide lesjoner. Fire av de fem pasientene med DNA-aneuploide lesjoner utviklet et plateepitelkarsinom i munnhulen i løpet av observasjonstiden (fig 4). Kun en av 40 pasienter med euploide lesjoner utviklet kreft i løpet av observasjonstiden.
I sum viser disse to undersøkelsene at grove genomiske avvik kan brukes til å forutsi forekomsten av plateepitelkarsinomer i munnhulen med stor grad av sikkerhet, uavhengig av hvilken histologisk diagnose disse pasientene har fått. DNA-ploiditet samsvarer ikke med histologisk gradering av dysplasier, og slik gradering har meget begrenset prognostisk verdi (20, 38, 39). I tillegg viser våre undersøkelser at grove genomiske avvik kan brukes til å identifisere pasienter med høy risiko blant pasienter som ellers ikke ville blitt mistenkt for å ha lesjoner som representerte forstadier til kreft. Konklusjonen etter disse studiene er derfor at grove genomiske avvik (DNA-aneuploiditet) som eneste prognostiske markør kan brukes til å forutsi det kliniske forløpet i alle typer hvite flekker som oppstår i munnhulen.
Figur 4 Overlevelseskurver for 45 pasienter med ikke-dysplastiske biopsier i henhold til DNA-ploiditetsklassifikasjon. Av 40 pasienter med DNA-diploide eller -tetraploide lesjoner, fikk kun en pasient senere et karsinom, 74 måneder etter første biopsi. Av totalt fem pasienter med DNA-aneuploide lesjoner fikk fire pasienter senere et karsinom, 61, 63, 98 og 98 måneder etter første biopsi (p< 0,05 med Fishers eksakte test)
Erytroplakier med innhold av dysplasi
Røde flekker i munnslimhinnen har en langt mer uttalt tendens til malign transformasjon enn hvite flekker, men forekommer sjeldnere (18). I enkelte studier angis den maligne transformasjonsraten å ligge på 90 % (18, 19). Det er derfor sjelden at man finner pasienter med røde flekker som histologisk viser seg å være premaligne lesjoner. Vi har identifisert 37 slike pasienter, og undersøkt 57 biopsier fra disse med hensyn til DNA-ploiditetsstatus. 25 (67 %) pasienter hadde DNA aneuploide lesjoner. I løpet av en observasjonsperiode på om lag sju år utviklet 23 (92 %) av disse pasientene et munnhulekarsinom (40). Ingen av pasientene med DNA-diploide (normale lesjoner) utviklet karsinom i løpet av observasjonsperioden (fig 5).
Figur 5 Overlevelse (sykdomsfri (A)- eller total (B)) hos pasienter med erytroplakier i munnhulen, i henhold til DNA-ploiditetsklassifikasjon. Figuren er omarbeidet etter Sudbø og medarbeidere (40 ) og er gjengitt med tillatelse fra American Society of Clinical Oncology
Behandlingsalternativer
Munnhulen kan tjene som et modellsystem for studier på kjemoprevensjon, fordi premaligne lesjoner her lett kan identifiseres og følges opp. Slike lesjoner er dessuten forbundet med forekomst av karsinomer i andre avsnitt av øvre aerodigestive kanal. Til tross for den opplagte muligheten man har hatt til å identifisere munnhulekarsinomer på et tidlig stadium, er langtidsoverlevelsen dårlig, og forekomsten øker, spesielt i yngre aldersgrupper. Årsakene til dette kjenner man ikke fullt ut, men det foreligger store geografiske forskjeller, også i den vestlige verden. Økningen i insidens er spesielt stor sør og øst i Europa.
Den kliniske verdien i tidlig kartlegging av orale leukoplakiers maligne potensial skyldes at det i dag finnes mulige behandlingstiltak. De mest opplagte mulighetene er fotodynamisk terapi i kombinasjon med aminolevulinsyre, samt behandling med en COX-2-hemmer.
Kjemoprevensjon
Medikamentell behandling av premaligne lidelser i munnhulen er gjennomført i flere studier (41 – 47), men den kliniske effekten er diskutabel av to årsaker (48, 49): bivirkningsprofilen til retinoider, som har vært mest brukt, og mangel på faktorer som sikkert identifiserer høyrisikogrupper (36). Slik medikamentell forebyggende behandling forutsetter dessuten at man med stor sensitivitet og spesifisitet kan identifisere pasienter som i særlig grad er utsatt for å få kreft. Høyrisikoindivider vil kunne identifiseres ved å kartlegge DNA-innhold i leukoplakier og randomisere pasienter med DNA-aneuploide og -tetraploide lesjoner til ulike behandlingsgrener, fordi man ved hjelp av disse analysemetodene finner frem til høyrisikopasientene. I tillegg har metodene stor spesifisitet; pasienter med DNA-diploide lesjoner kan man med stor grad av sikkerhet (97 % sikkerhet) la være å behandle. Disse analysemetodene er derfor velegnet som verktøy for opportunistisk screening.
Nyere medikamenter med langt gunstigere bivirkningsprofil og sannsynlig effekt på orale premaligne tilstander er nå tilgjengelige (50 – 53) og vil kunne brukes i en randomisert studie hos pasienter med premaligne lesjoner i munnhulen.
Epidemiologiske studier antyder at ikke-steroide antiinflammatoriske midler reduserer risikoen for å få kolorektalkreft, delvis ved hemming av prostaglandinsyntesen. Cyklooksygenase, som er det hastighetsbestemmende enzymet i prostaglandinsyntesen, finnes i to isoformer, cyklooksygenase 1 og 2 (COX-1 og COX-2). Genetiske og farmakologiske studier viser at COX-2 sannsynligvis er av betydning for utvikling av flere kreftformer.
Celecoxib, som induserer apoptose ved selektivt å hemme enzymet cyklooksygenase-2 (COX-2) er nylig i en randomisert studie vist å ha en reduserende effekt på størrelsen og antallet kolorektale polypper i høyrisikoindivider, med familiær adenomatøs polypose. I disse lesjonene vises regelmessig en økt ekspresjon av COX-2 og dette danner grunnlaget for bruk av celecoxib. Vi har i en foreløpig upublisert studie vist at COX-2-ekspresjonen er økt i premaligne og maligne lesjoner i munnhulen, sammenliknet med normal munnslimhinne. Dette gir en antydning om at disse medikamentene også kan brukes som kreftforebyggende medikamenter hos høyrisikopasienter med munnhulekreft.
Lokalbehandling med lys (fotodynamisk terapi)
Fotodynamisk terapi er en behandlingsform som er basert på at et fotosensitiviserende substans i kombinasjon med belysning av en bestemt bølgelengde, gir en selektiv celle- og vevsskade i de områder man ønsker å behandle. Behandlingsformen er ikke ny (54), men har tidligere ikke blitt brukt i stor utstrekning på orale premaligne lesjoner.
5-aminolevulinsyre (ALA) inngår i den mitokondrielle syntesen av hem fra protoporfyrin IX (PpIX), og syntesen av PpIX er et hastighetsbestemmende trinn i denne prosessen. Det er vist at intracellulær PpIX hoper seg opp i epiteliale celler når de er blitt eksponert for ALA. PpIX kan aktiveres av lys i bestemte bølgelengder, med celleskade til følge. Celledøden skyldes først og fremst mitokondriell skade.
Metylesteren til ALA, metyl 5-aminolevulinate (Metvix, Photocure, Oslo) er for tiden under utprøvning ved Det Norske Radiumhospital, hos pasienter med basalcellekarsinom, og en studie på munnhulelesjoner er planlagt. Farmakokinetiske studier har vist at det foreligger et selektivt opptak i slimhinneområder hvor det foreligger patologiske forandringer, som lichen ruber planus. ALAs selektive opptak til patologisk endret vev gjør den spesielt egnet som sensitiviseringssubstans før lysbehandling av premaligne lesjoner.
Diskusjon
Måling av DNA-innhold synes å være langt overlegen andre tilgjengelige undersøkelsesmetoder for å forutsi det kliniske utfallet hos pasienter med dysplastiske hvite flekker på et tidlig tidspunkt. En kartlegging av grove genomisk avvik har også en høy prognostisk verdi hos pasienter med erytroplakier i munnhulen. Bestemmelse av DNA-ploiditet er derfor en prognostisk markør i et vidt spekter av biologisk svært ulike lesjoner. Det kan derfor tenkes at metodene kan brukes til prognostisk kartlegging av premaligne lesjoner også i andre overflatevev. Våre data viser at det er mulig, med stor grad av sikkerhet, å identifisere pasienter med munnhulelesjoner som vil gi opphav til kreft. Det finnes i dag muligheter til å intervenere mot slike forstadier til kreft, i en pasientgruppe som ellers først kommer til behandling i langtkomne stadier av sin kreftsykdom. Pasienter med DNA-aneuploide og tetraploide dysplasier bør derfor få et tilbud om behandling. I Norge blir alle dysplastiske orale leukoplakier innrapportert til Kreftregisteret, og disse pasientene kan derfor lett identifiseres og inviteres til en undersøkelse og eventuelle behandling. I tillegg vil personer med høyrisikoatferd (røyking, stort alkoholforbruk) kunne identifiseres gjennom data innsamlet fra Statens helseundersøkelser. Blant disse kan man finne frem til personer med DNA-aneuploide lesjoner og tilby behandling før invasiv kreft utvikles. Det er gitt tilsagn fra Sosial- og helsedepartmentet om at analyse av DNA-innhold i cellekjerner i munnslimhinneforandringer hos pasienter med høyrisikoatferd er en undersøkelse som vil dekkes over trygdebudsjettet.
T. Warloe er patentinnehaver for patentet som benyttes kommersielt av PhotoCure ASA. Det Norske Radiumhospital har aksjer i PhotoCure ASA.
