HIV-1-resistens mot antiretrovirale midler

Utvikling av resistens og behandlingssvikt

Prognosen for pasienter med ubehandlet HIV-1-infeksjon er dårlig, med høy sykelighet og dødelighet. De første behandlingsforsøkene ved HIV-1-infeksjon, monoterapi med zidovudin, ble satt i gang allerede i slutten av 1980-årene, men terapien førte relativt raskt til oppkomst av resistente virus. Etter at en mer effektiv antiretroviral kombinasjonsbehandling ble innført for drøyt fem år siden, har livssituasjon og prognose bedret seg betraktelig, og antall AIDS-tilfeller og sykehusinnleggelser har vist en dramatisk reduksjon. Behandlingen eliminerer ikke virus, men kan effektivt redusere produksjonen av nye viruspartikler. Virusmengden i blodplasma synker dermed til ikke-påvisbare nivåer, immunsystemet blir delvis restituert, antall CD4-positive T-celler i blodet stiger og pasientens immunsvikt reverseres. Når behandlingen fungerer og pasientene tåler medisineringen, kan de leve et nesten normalt liv.

I Norge er det mellom 1 600 og 1 700 personer som lever med HIV-1-infeksjon (3). Trolig har et flertall av disse pasientene fått tilbud om behandling. Behandling av HIV1-infeksjon retter seg mot to av virusets essensielle enzymer, revers transkriptase og protease. Behandlingen betegnes som HAART, et engelsk akronym for ”highly active antiretroviral therapy”, og består vanligvis av at pasienten tar en kombinasjon av tre til fire ulike medikamenter flere ganger daglig. Monoterapi favoriserer utvikling av resistente kvasispesies, mens kombinasjonsbehandling rettet mot både revers transkriptase og protease kan holde replikasjonen så lav at risikoen for å utvikle resistens minker.

Som følge av den høye mutasjons- og replikasjonsfrekvensen av HIV-1 skjer mutasjoner spontant og tilfeldig og uavhengig av medikamentell behandling, noe som betyr at det kan finnes resistente virusvarianter i individet allerede før behandlingen har begynt. De muterte enzymene i resistente virus har ofte dårligere enzymatisk funksjon enn enzym i villtypevirus. Skal resistente virus overleve, må det derfor finnes et miljø som fremmer resistente virus på bekostning av virus som er følsomme for medisinene. Resistente virus har oftest lavere potensial for overlevelse (fitness) og klarer seg dårligere i konkurransen med villtypevirus i fravær av det selektive trykket fra medikamentene. Det betyr at når behandlingen slutter, kommer det følsomme villtypeviruset tilbake. Man har da mulighet til å bytte til en annen medisinkombinasjon om man kjenner til hvilke mutasjoner som er oppstått.

Resistensbestemmelse

For å kunne tilby optimal behandling er det nødvendig å resistensbestemme HIV-1 ved behandlingssvikt. En ytterligere grunn til resistensundersøkelse er at behandlingssvikt hos pasientene ikke alltid skyldes at virus er blitt resistent. Medisineringen er svært krevende. Oftest innebærer HAART et stort antall tabletter som skal tas ved bestemte tidspunkter. På grunn av bivirkninger kan etterlevelse være et stort problem. Suboptimale medikamentkonsentrasjoner kan også skyldes nedsatt absorpsjon eller ulikheter i leverenzymaktivitet slik at medisinene metaboliseres raskere. Med resistensundersøkelse kan man relativt raskt få svar på om det som oppfattes som sviktende behandlingseffekt, skyldes forekomst av resistensmutasjoner hos pasientens virus.

For bestemmelse av HIV-1-resistens benyttes det to ulike teknikker. Ved fenotypisk resistensundersøkelse analyseres om pasientens virus har evnen til å formere seg i nærvær av ulike konsentrasjoner av anti-HIV-1-medikamenter. Metoden er teknisk komplisert, foregår i cellekultur, krever sikkerhetslaboratorium, tar lang tid å utføre og er kostbar. Den utføres ennå ikke i Norge.

Ved genotypisk resistensundersøkelse isoleres først HIV-1-RNA fra pasientens plasma. HIV-1-RNA danner så utgangspunkt for tre ulike polymeriseringsreaksjoner. I den første reaksjonen foretas en revers transkripsjon der en stor del av virusets polymerasegen kopieres fra RNA til DNA. Polymerasegenet undersøkes fordi det koder for enzymene protease og revers transkriptase. I den andre reaksjonen, en polymerasekjedereaksjon (PCR), amplifiseres polymerasegenets DNA. Til slutt utføres en eller flere sekvenserings-PCR-er med basis i produktet fra amplifikasjons-PCR, for å fastslå nukleotidsekvensen og aminosyreskevensen i polymerasegenet (fig 1). Aminosyresekvensen fra pasientens virus sammenliknes deretter med aminosyresekvensen fra et såkalt villtypevirus for å kunne identifisere eventuelle mutasjoner som er funnet å være assosiert med resistens mot bestemte antiretrovirale midler (fig 2).

Figur 1   Antiretroviral behandling av HIV-1-infeksjon er rettet mot enzymene protease og revers transkriptase. Begge enzymene kodes fra polymerasegenet i HIV-1-genomet. Genotypisk resistenstesting utføres ved å sekvensere og analysere deler av polymerasegenet. Sekvensering utføres ved å la spesifikke primere (pil) binde seg til det genområdet som ønskes sekvensert

Figur 2   Utsnitt av aminosyresekvenser fra HIV-1-genomet hos pasient behandlet med medikamenter rettet mot enzymene protease og revers transkriptase. Proteasegenet ble sekvensert med primeren JA204 og revers transkriptase-genet ved hjelp av primeren JA205. Sekvensene fra pasientens virus er sammenliknet med tilsvarende sekvenser hos et såkalt villtypevirus. Sammenstilling av sekvenser ble gjort med programmet ClustalX. Mutasjoner angitt med gult indikerer polymorfismer som ikke nødvendigvis fører til medikamentell resistens. Mutasjoner angitt med rødt viser mutasjoner assosiert med høygradig medikamentell resistens

Både fenotypisk og genotypisk testing av resistens er forbundet med store metodologiske problemer. Sensitiviteten kan være et problem ved for lavt nivå av virus i plasma eller når mutanten representerer for lav andel av pasientens kvasispesies. For å få et reelt bilde av virusets resistensmønster er det derfor viktig at pasientene tar den aktuelle medisineringen på undersøkelsestidspunktet.

En ulempe med den genotypiske analysen er at det er vanskelig å avgjøre om de identifiserte mutasjonene finnes i en og samme viruspartikkel eller om de er fordelt på ulike viruspartikler. I tillegg kan mange mutasjoner som ikke fører til resistens påvises. Det er kun mutasjoner som fører til aminosyresubstitusjon som kan bidra til medikamentell resistens. Enkelte aminosyresubstitusjoner har ingen relasjon til medikamentell seleksjon, og betegnes som naturlig polymorfisme. Disse kan likevel bidra til å øke resistensen ved samtidig tilstedeværelse av andre mutasjoner i samme enzym. Hvilken aminosyre som substitueres i forhold til villtypevirusets aminosyre, har stor betydning for grad og spesifisitet av medikamentell resistens.

Egne metodiske erfaringer

Siden høsten 1998 har Avdeling for mikrobiologi og immunologi, Gades Institutt, som eneste laboratorium i Norge rutinemessig analysert HIV-1 for mutasjoner assosiert med medikamentell resistens. Vi har brukt publiserte primere og PCR-analysebetingelser (4, 5), men har også hatt tilgang til primere som ennå ikke er publisert (fra Jan Albert og Anders Sönnerborg, Huddinge Sjukhus, Stockholm). Som grunnlag for karakterisering av resistensmutasjoner har vi laget en algoritme basert på databaser koblet opp mot Los Alamos og Stanford University (6, 7). I disse databasene er de viktigste mutasjoner assosiert med HIV-1-medikamentell resistens lagt inn.

Det faktum at HIV-1 finnes i mange varianter hos hvert enkelt individ, stiller store krav til de primere som anvendes i det første RT-PCR-oppsettet, der virus-RNA fra plasma anvendes som substrat. Vår erfaring er at ca. 20 % av prøvene ikke gir produkt ved første forsøk og at de dermed må reanalyseres. Det andre polymeriseringstrinnet, der DNA amplifiseres, er relativt uproblematisk, men sekvenserings-PCR-trinnet er forbundet med problemer på grunn av virusets variabilitet. Nærmere 20 % av pasientprøvene har derfor måttet sekvenseres 2 – 5 ganger for å få lesbare sekvenser. Dette skyldes blant annet at vi i vår metode initialt analyserer to lange delvis overlappende sekvenser som derpå bearbeides manuelt. I motsetning til dette genererer de kommersielt tilgjengelige sekvenseringsmetodene 6 – 7 delvis overlappende sekvenser som analyseres i spesielle dataprogrammer. Dermed er det større sannsynlighet for å få gyldige sekvenser i første oppsett og man slipper resekvensering. For å øke servicen og for å effektivisere resistensanalysene har vi fra mai 2001 derfor valgt å bytte ut vår egenutviklede metode med ViroSeq1 fra Applied Biosystems. Dette er en standardisert og kvalitetssikret metode som også brukes i en rekke andre land.

Resultat og diskusjon

I perioden august 1998 til april 2001 analyserte vi til sammen 183 prøver fra 152 pasienter. Av disse var det 128 pasienter som fikk behandling eller som hadde avsluttet behandling av ulike grunner. Hos et flertall av pasientene med seponert behandling kunne det ikke påvises resistensrelaterte mutasjoner. Figur 3 viser fordelingen av de mutasjoner som er forenlige med høy og middels/medvirkende resistens overfor medikamenter mot revers transkriptase og protease. Mutasjoner som er forenlige med høygradig resistens mot proteasehemmere (posisjon 82 og 90) er relativt vanlig forekommende. Mutasjon 84, som er forenlig med kryssresistens mot de fleste proteasehemmere, er bare representert med sju tilfeller i vårt materiale. Fordelingen av resistensmutasjoner i revers transkriptase er forenlig med at mange pasienter har vært behandlet med nukleosidanalogene zidovudin og lamivudin (mutasjoner 69, 70, 184, 215), mens ikke-nukleosidanaloger som nevirapin og efavirenz ikke anvendes i like stor grad (mutasjoner 100, 103, 106, 181, 190).

Figur 3   Fordeling av aminosyresubstitusjoner i protease- (a) og revers transkriptase- (b) enzymene som er funnet forenlige med høygradig resistens (røde søyler) og middels eller medvirkende resistens (gule søyler) mot antivirale medikamenter

I behandlingssammenheng er det viktig å vite om forekomsten av eventuelle resistensmutasjoner hos pasientens virus vil påvirke behandlingsresultatet, og eventuelt hvor hyppig slike mutasjoner forekommer. Det er også viktig å få informasjon om det er spredning av resistente virus blant nysmittede, med tanke på hvilke konsekvenser dette kan få for fremtidige behandlingsmuligheter. I vårt materiale ble det påvist resistensmutasjoner i virus fra tre nylig smittede pasienter, mens fem andre nylig infiserte og 22 ubehandlede pasienter med lengre tids infeksjon hadde villtypevirus eller mutasjoner som kan assosieres med nedsatt medikamentell følsomhet. Pasientene med nylig smitte hadde mutasjoner assosiert med resistens mot zidovudin og proteasehemmere og en mutasjon assosiert med bruk av ikke-nukleosidanaloger. Resistensmønsteret hos smittekildene er ikke kjent (Vidar Ormaasen og Dag Kvale, Ullevål sykehus, Oslo, personlig meddelelse). At tre av åtte pasienter som var smittet de siste to årene har virus med resistensassosierte mutasjoner, betyr ikke nødvendigvis utstrakt spredning av slike virus, men understreker betydningen av å undersøke for resistens hos nylig smittede pasienter. Hos virus fra enkelte pasienter forekom forandringer som ble oppfattet som naturlig polymorfisme, og for 14 pasienter med slike virusforandringer hadde dette ingen betydning for behandlingen, da samtlige pasienter fikk den forventede reduksjonen av virus i plasma (8).

Avslutning

Unnvikelse av immunsystemet og resistensutvikling er to sider av samme evolusjonære prosess, og skyldes den høye reproduksjons- og mutasjonsraten av HIV-1. Til tross for utvikling av nye antiretrovirale medikamenter kommer resistensproblematikken til å vedvare. Selv om behandlingsmålet er satt til HIV-RNA< 50 kopier/ml vil nok mange klinikere oppleve dette kravet som relativt strengt, all den tid mange pasienter med påvisbart HIV-1-RNA i plasma likevel vil respondere på HAART med økning av CD4-tall og bedring av immunstatus.

Erfaringer fra flere studier har vist at resistenstesting er kostnadseffektivt (9, 10). Resistenstesting gir behandlende lege bedre mulighet til å avgjøre hvilke medikamenter viruset har utviklet resistens mot og hvilke midler som sannsynligvis er virksomme. Man skal heller ikke utelukke at det er manglende etterlevelse og ikke resistens som er årsaken til pasientens høye HIV-1-RNA-verdier i plasma. Genotypisk resistensbestemmelse er også hensiktsmessig å utføre dersom pasienten på bakgrunn av klinisk observasjon antas å ha multiresistente virus. Dersom det ikke finnes passende medisiner å bytte til, kan det være aktuelt å avbryte en kostbar og plagsom behandling. Alternativt, dersom viruset er multiresistent, men pasienten tåler behandlingen, kan det være bedre å fortsette medisineringen. Det er fordi et kraftig mutert virus som regel har lavere overlevelsespotensial enn villtypeviruset har i fravær av medikament, slik at mengden virus i plasma dermed kan holde seg på moderate nivåer.