Levende organismer har utviklet raske og generelle forsvarsmekanismer for å beskytte seg mot skadelig påvirkning utenfra. Forsvarsmekanismene blir inndelt i uspesifikt eller medfødt immunsystem og spesifikt eller ervervet immunsystem. Det spesifikke immunsystemet har høy spesifisitet og ”hukommelse”, mens det uspesifikke systemet har ingen ”hukommelse” og liten eller ingen spesifisitet. Det spesifikke immunsystemet må induseres for å kunne virke. Ved mikrobielle angrep vil dette systemet ofte være for tregt initialt til å hindre infeksjonssykdom. Det uspesifikke immunsystemet er stort sett alltid til stede, eventuelt induseres det meget raskt og meget effektivt. Det er derfor ikke overraskende at de fleste patogene bakterier er spesielt godt utrustet for å unngå det uspesifikke immunsystemet. Det uspesifikke og det spesifikke forsvaret er imidlertid avhengige av hverandre for å kunne virke optimalt.
Antimikrobielle peptider
Antimikrobielle peptider ble oppdaget av to uavhengige forskergrupper. En gruppe i Sverige undersøkte hvordan insekter kunne drepe bakterier (1), mens en gruppe i California studerte hvordan fagocytter dreper bakterier inne i fagolysosomet (2). Ganske raskt ble man klar over at disse peptidene finnes i alle levende spesies – fra planter til insekter og dyr. Antibakterielle peptider er også funnet i nesten alle bakteriespesies man har undersøkt. I motsetning til peptider produsert av eukaryote celler, blir peptider produsert av prokaryotiske celler ofte betydelig modifisert kjemisk før de blir aktivert og utskilt. I denne artikkelen skal jeg begrense meg til å omtale peptider produsert av eukaryote celler, med spesiell vekt på peptider produsert av pattedyr, inklusive mennesker.
Definisjon av antimikrobielle peptider
Det er i dag to forskjellige definisjoner på antimikrobielle peptider. Hancock & Scott (3) definerer antimikrobielle peptider til å være positivt ladede peptider med mellom 12 og 50 aminosyrer, og med ca. 50 % hydrofobiske aminosyrer. Ganz & Lehrer (4) har en bredere definisjon som inkluderer positivt ladede peptider med mindre enn 100 aminosyrer.
I praksis er det liten forskjell på disse to definisjonene, da de fleste naturlig forekommende, positivt ladede peptidene har en størrelse som ligger mellom 12 og 50 aminosyrer. For noen år siden delte man inn disse peptidene etter hvor de ble isolert. Etter som dette feltet har vokst til å omfatte mer enn 500 peptider, har man gått over til å dele dem inn etter struktur (3, 5). Selv om enkeltstrukturene kan ha store forskjeller, ser det ut til at det bare er to strukturelle hovedforskjeller i den tredimensjonale strukturen, og disse to hovedstrukturene har også klare likhetstrekk. Sannsynligvis gjenspeiler dette likhetspunkter i virkningsmekanismer.
I tillegg til disse peptidgruppene finnes det en rekke animalske proteiner som har antibakterielle egenskaper grunnet små positivt ladede peptider inne i disse proteinene.
Antimikrobielle peptider i mennesker
Antimikrobielle peptider finnes i en rekke organer i mennesker. De er spesielt rikholdige i organer som er eksponert mot omverden, som luftveier, hud, tarm, urinveier, genitalia, samt i fagocytterende hvite blodceller.
Hvite blodceller . I de polynukleære hvite blodcellene finnes en rekke forskjellige proteiner og peptider (tab 1). Mens proteinene og peptidene i de primære granula er spesielt velegnet til å drepe og fordøye mikrober, er tilsvarende strukturer i de sekundære granula mer spesialisert til å delta i inflammasjonsprosesser, selv om også disse kan delta i mikrobedrap.
De primære granula vil smelte sammen med fagosomet og danne fagolysosom, mens de sekundære granula vil tømme sitt innhold eksternt. Ved cellelysis vil proteiner og peptider bli frigjort fra cytoplasma og tømmes ut i nærmiljøet (fig 1).
Figur 1 Forskjellige mekanismer for frigivelse av antimikrobielle proteiner og peptider
Tabell 1 Antimikrobielle peptider/proteiner i hvite blodceller. Størrelse i kD i parentes. Laktoferrin og katelicidin har splittprodukter (etter skråstrek) som defineres som antimikrobielle peptider
Primære granula
(kD)
Sekundære granula
(kD)
Peroksidase
(150)
Laktoferrin
(80)/5/1,2
BPI
(60)
Lysozym
(14)
Serprocidiner
(30)
Fosfolipase A2
(14)
Lysozym
(14)
Katelicidin
(18)/5
Defensiner
(4)
Tarm . Antimikrobielle peptider er funnet i store mengder i tynntarm i forskjellige dyrearter. I Panethske celler er det påvist antimikrobielle proteiner som lysozym, fosfolipase A2 og antimikrobielle peptider som kryptdiner i mus (6) og α -defensiner som HNP-5 og HNP-6 hos mennesker (7). Av spesiell interesse er funn av cecropiner i tynntarm hos gris (10). Cecropiner er ellers spesielt assosiert med insekter (5), og funn av liknende, dog ikke identiske strukturer i pattedyr, tyder på at antimikrobielle peptider er godt bevart gjennom utviklingen av forskjellige spesies. Det er antatt at de antimikrobielle peptidene i tynntarm spiller en vesentlig rolle i å holde antall mikrober på et relativt lavt nivå der.
Luftveier . For mer enn 70 år siden rapporterte Fleming at humant luftveissekret kunne drepe bakterier (11). De mest rikholdige antimikrobielle faktorene i luftveiene er lysozym, laktoferrin og sekretorisk leukoproteinaseinhibitor (SLPI) (12 – 15). I luftveiene finnes ellers antimikrobielle peptider som LL-37 og β -defensiner som humant β -defensin 1 og 2 (HBD-1 og HBD-2) (16). β -defensiner er litt større enn α -defensiner og består av 38 – 42 aminosyrer. HBD-1 ble nylig vist å være konstitutivt til stede i spyttkjertler og i gingiva (17) og i luftveisepitel i de nedre luftveier (18), mens en forskningsgruppe i Tromsø viste at HBD-1 ble uttrykt i trommehinne og ytre øregang (19). Det er vist i dyreforsøk at det finnes andre β -defensiner som er induserbare i luftveiene, bl.a. av bakteriebestanddeler som lipopolysakkarid (20) (fig 2). Det er antatt at antimikrobielle proteiner og peptider er viktige forsvarsmekanismer i luftveiene.
Figur 2 Indusering av produksjon av trakealt antimikrobielt peptid (TAP) ved stimulering av bakterielle produkter, lipopolysakkarid (LPS) og lipoteikonsyre (LTA) som reagerer med CD14. TNF og IL-1 kan også indusere økt produksjon av TAP
Hud . To klasser av antimikrobielle peptider er beskrevet i hud hos mennesker, β -defensiner og katelicidiner (21 – 24). Nærmere analyser viste tilstedeværelse av HBD-2 og LL-37 i keratinocytter som var stimulert enten av bakterier eller av sykdommer som psoriasis og systemisk lupus erythematosus. I ikke-stimulerte celler kunne man ikke påvise disse peptidene. Analyse av sårvæske fra hud har vist at denne inneholder HBD-2, LL-37 og α -defensinene HNP-1, HNP-2 og HNP-3 samt lysozym og andre stoffer med sannsynlig opphav i hvite blodceller (25).
Av de proteinene og peptidene som er listet opp i tabell 1, er det bare defensiner og splittprodukter fra laktoferrin og katelicidin som inngår i definisjonen på antimikrobielle peptider. Defensiner er spesielt rikholdig i polymorfonukleære celler, og utgjør mer enn 5 % av proteininnholdet i disse cellene hos de fleste pattedyr, inklusive mennesker (2). Defensiner er imidlertid ikke funnet i polymorfonukleære celler fra mus, mens de utgjør 18 % av det totale proteininnholdet i kaningranulocytter (4, 6, 7). Dette viser hvor vanskelig det kan være å overføre resultater fra dyreforsøk til mennesker. I granulocytter fra mennesker finnes det hovedsakelig tre typer defensiner (human neutrophil defensins, HNP-1 – 3). De utgjør 99 % av det totale defensininnholdet i disse cellene, mens HNP-4 står for resten. Disse defensinene kalles med et fellesnavn for α -defensiner, og aktive α -defensiner består av 29 – 35 aminosyrer. Man har beregnet at det finnes ca. 3 – 5 µg per million humane nøytrofiler. Det finnes ca. 1 000 defensininneholdende granula per nøytrofil. Det er beregnet at de fagocytterende vakuolene vil inneholde 1 – 10 mg/ml defensin. De fleste mikrober vil bli drept ved konsentrasjoner på 10 – 100 µg/ml. Konsentrasjonen av HNP-1 – 3 i plasma hos normale individer er ca. 40 ng/ml, men øker til mer enn 1 µg/ml ved alvorlige bakterieinfeksjoner (8, 9). Den lokale konsentrasjon av defensin
er i infisert vev er sannsynligvis langt høyere (4).
Antimikrobielle peptiders virkeområde
Antimikrobielle peptider fra eukaryote celler kan virke mot en rekke forskjellige bakterier, og mot sopp, enkelte kappekledde virus, parasitter og enkelte kreftceller (3).
Noen peptider virker best mot grampositive bakterier, andre har størst effekt på gramnegative. Defensiner virker generelt bedre mot grampositive bakterier (4), mens cecropiner isolert fra gris og insekt virker best mot gramnegative bakterier (5).
Noen få bakteriespesies er naturlig resistente mot de fleste peptider (5). Dette gjelder blant annet Proteus og Bacillus, mens enkelte Salmonella- og Yersinia-arter kan ha nedsatt følsomhet.
Det er gjort mindre forskning på virus, men det er påvist antiviral effekt av enkelte peptider mot HIV, Herpes simplex-virus (HSV) og cytomegalovirus (CMV) (26). Laktoferrin, et jernbindende protein hvor man kan splitte av et lite, antimikrobielt peptid (27), er kjent å kunne virke mot HIV (28), cytomegalovirus (29), HSV1 og HSV2 (30), hepatitt C-virus (HCV) (31), et rotavirus fra aper (32) og poliovirus type 1 (33).
Antifungal effekt av enkelte av disse peptidene in vitro, både mot gjærsopp og muggsopp, er godt dokumentert (34 – 36). Det er også påvist at enkelte av peptidene kan redusere størrelsen av visse solide svulster av musecellelinjer og humane cellelinjer (37, 38).
I tillegg til deres antimokrobielle og cytotoksiske egenskaper virker noen defensiner kjemotaktisk (39). Det er vist at enkelte peptider kan ha en gunstig effekt på sårtilheling (21, 40).
Det kan virke som en selvmotsigelse at kroppen har et forsvarssystem som både angriper mikrober og visse eukaryote celler. Teoretisk vil dette også kunne være en stor ulempe i utviklingen av nye antimikrobielle midler, som nå pågår intenst. Imidlertid er det systemer som beskytter kroppen mot peptidene, samtidig som de fleste peptidene virker selektivt mot prokaryote celler.
Syntese av antimikrobielle peptider
Defensin er syntetisert som et preprodefensin som består av 93 – 95 aminosyrer (fig 3). Det inneholder 19 aminosyrer som er en signalsekvens som styrer defensinet til det endoplasmatiske retikulum (predel), og en sekvens av 40 – 45 aminosyrer med anioniske egenskaper (prodel). Man mener at denne anioniske aminosyresekvensen nøytraliserer den aktive kationiske peptidsekvensen. Ved stimulering blir den anioniske sekvensen kløyvd av og peptidet aktivert (41). På denne måten blir de eukaryote cellene beskyttet så lenge peptidet forblir intracellulært. Defensiner kan syntetiseres konstitutivt eller induseres, avhengig av celletyper og organer.
Figur 3 Defensin og cecropin produserer ett molekyl prepropeptid fra hver transkripsjon, mens magainin produserer ett molekyl med en predel og flere propeptider fra hver transkripsjon. Predelen er et signalmolekyl som dirigerer peptidet til det endoplasmatiske retikulum, mens prodelen er en anionisk del som inaktiverer peptidet. Magainin er peptid isolert fra frosk
Antibakteriell virkningsmekanisme
Antimikrobielle peptider er positivt ladede molekyler. Den initiale kontakt med målet er en elektrostatisk binding til negativt ladede strukturer. I bakteriene er dette hos gramnegative bakterier lipopolysakkarider i ytre cellevegg (42), mens det hos grampositive bakterier er diskutert om den initiale binding foregår mellom peptid og teikonsyre og/eller lipoteikonsyre. Forsøk i vårt laboratorium tyder på at teikonsyre er det initiale mål (43). Peptidene ødelegger deler av celleveggen, og går deretter gjennom den ødelagte celleveggen for å nå et av sine angrepspunkter, cytoplasmamembranen. Dette kalles egenskapt opptak (”self-promoted uptake”) (44). I cellemembranen er det påvist flere virkningsmekanismer.
I figur 4 er de to vanligste mekanismene skissert. I tønnestavmodellen aggregerer peptidene loddrett i cytoplasmamembranen og danner en pore. Disse peptidene er amfipatiske, det vil si at de er både vannløselige og fettløselige. Den fettløselige delen står ut mot cytoplasmamembranen slik at den vannløselige delen vender inn i poren. Dette tillater vannløselige stoffer og vann å gå gjennom poren.
Figur 4 De to vanligste virkningsmekanismene for antimikrobielle peptider. I tønnestavmodellen aggregerer flere peptider loddrett i cytoplasmamembranen og danner en pore. I teppemodellen fester mange peptider seg parallelt med cytoplasmamebranen slik at denne bukler seg. Den kan til slutt brytes opp og danne porer
I teppemodellen setter peptidene seg ned parallelt med cytoplasmamembranen med sin fettløselige del nedsunket i membranen, og presser fosfolipidene fra hverandre. Når mange nok peptider har sunket ned i cytoplasmamembranen, begynner denne å bukle seg, og vil til slutt brytes opp, slik at man også i denne modellen vil få porer som er dekket av peptider.
Det finnes også to mer sjeldne mekanismer. I hode-hode-modellen er peptidene for små til alene å danne bro over cytoplasmamembranen. Disse danner derfor dimerer, enten ved å binde seg hode til hode eller hode til hale. Disse peptidene er slik laget at det vil danne seg en pore sentralt gjennom peptidet. Det mest kjente peptidet som man antar virker med en slik modell, er gramicidin. Dette er et peptid som har vært kjent i mange år, og som blant annet er tilsatt i Kenacort munnsalve.
Den siste modellen, aktiv transport, er bare kjent for ett peptid, valinomycin, som produseres av Streptomyces. Valinomycin fungerer som en ionebærer og transporterer bl.a. kaliumioner over cytoplasmamembranen. Denne mekanismen er mye tregere enn poredanning, og transporterer ca. 1 000 ganger færre ioner enn poredannere per tidsenhet.
Peptidene virker fortrinnsvis på bakterienes cytoplasmamembran, men det er flere grupper som har vist at enkelte peptider kan inhibere proteinsyntesen og virke direkte på DNA (45, 46).
Den initiale elektrostatiske binding er helt sentralt for at peptidene skal virke. Dette forklarer også selektiviteten mot prokaryote celler og sopp, da høyere eukaryote celler har en tilnærmet nøytral cellemembran.
Andre, ikke-kationiske peptider
I 1968 fant Galask & Snyder (47) at amnionvæske inhiberer veksten av flere bakteriearter. Man isolerte et negativt ladet peptid som krever sink for å ha antimikrobiell aktivitet (48). Senere har man isolert flere tilsvarende anioniske peptider fra lunger hos mennesker og sau (49, 50). Dette er meget små peptider som består av bare 7 – 8 aminosyrer. Virkningsmekanismen til disse peptidene er foreløpig stort sett ukjent.
Sykdommer assosiert med defekter i de antimikrobielle peptider
Få, om noen sykdommer, synes å involvere defekter i de antimikrobielle peptiders funksjoner.
Chédiak-Higashis syndrom er en sjelden autosomal, recessiv tilstand. Sykdommen involverer blant annet funksjonen til alle sorter hvite blodceller. Det oksidative bakteriedrapet synes å være intakt, men det intracellulære drapet er nedsatt. Vanligvis får pasientene 3 – 6 alvorlige infeksjonsperioder årlig, og de fleste dør i barneårene. Syndromet er så vidt komplekst at det er vanskelig å vurdere om defekter i de antimikrobielle peptidenes funksjoner spiller en vesentlig rolle.
Spesifikk granuladefekt (specific granule deficiency) er en sjelden tilstand med residiverende infeksjoner. Pasientene synes å mangle granula i sine hvite blodceller, og de mangler laktoferrin og defensiner. De synes også å ha nedsatt oksidativt drap, og er utsatt for gjentatte infeksjonsepisoder i barneårene. Det er også ved denne meget sjeldne tilstanden vanskelig å vurdere effekten av mangel på antimikrobielle peptider.
Det er uklart hva som leder til infeksjoner i luftveiene hos pasienter med cystisk fibrose. En nyere forklaringsmodell tar utgangspunkt i at de fleste antimikrobielle peptider har dårlig eller ingen effekt ved høye saltkonsentrasjoner. Produksjonen av peptider i luftveiene synes å være normal hos pasienter med cystisk fibrose. Elegante forsøk utført på cellekulturer har vist at ved saltkonsentrasjoner lik den denne pasientgruppen har i bronkiene, fungerer ikke peptidene. Ved å fortynne bort saltet, gjenvinner peptidene sin gode antibakterielle effekt (12, 51). Ytterligere forskning er imidlertid nødvendig før man kan etablere en sikker sammenheng mellom bakterielle infeksjoner i luftveiene hos cystisk fibrose-pasienter og ikke-funksjonelle peptider i luftveiene hos denne pasientgruppen.
Mulige anvendelsesområder
Med den utviklingen av resistens mot eksisterende antibiotika som i dag foregår, er behovet for helt nye antibiotika stort. Kationiske peptider kan ha mange av de ønskede egenskaper hos nye antibiotika.
Virkningsmåte . De fleste peptidene er bredspektrede med effekt både på grampositive og gramnegative bakterier. De er overveiende baktericidale, og de dreper bakteriene meget raskt. Peptidene synes å ha ingen eller meget kort postantibiotikaeffekt (egne observasjoner).
Resistens . Peptidene synes å være lite affisert av vanlige, kjente antibiotikaresistensmekanismer (3), selv om enzymatisk nedbrytning av peptidene synes å være en forsvarsmekanisme bakteriene benytter seg av (52). Andre resistensmekanismer er påvist, og teoretisk kan man tenke seg flere mulige mekanismer som bakteriene vil benytte (53).
Bruksområder . Strukturen til de naturlig forekommende kationiske peptidene synes å kunne legge en begrensning på anvendelsesområdene. De fleste peptider består av mer enn 20 aminosyrer, noe som gjør det umulig med dagens teknikker å bruke dette som orale preparater. Samtidig blir de relativt lett inaktivert av salter, og man er usikker på hvor godt de penetrerer i vev og i hvor stor grad de vil forbli fri i serum. De blir også relativt lett inaktivert av proteaser. Dette har ført til at bruksområdene så langt mye har dreid seg om topiske anvendelser. Per i dag foregår to meget lovende kliniske forsøk. Et protegrinderivat, IB-367 (Intrabiotics, Mountain View, California), blir undersøkt for dets potensial mot oral mukositt, en polymikrobiell sykdom hos kreftpasienter. Peptidet MBI-226 (Micrologix Biotech, Vancouver) undersøkes i kliniske forsøk for å forsøke å sterilisere innstikksstedet ved intravenøs kateterbruk.
En helt annen lovende retning har forskningen tatt ved å prøve å utnytte de antimikrobielle peptidenes sterke binding til lipopolysakkarid (42). Det er nå kliniske forsøk i gang for å bruke deler av baktericidalt permeabilitetsøkende peptid (BPI, bactericidal permeability-increasing) for å hindre endotoksisk sjokk. Teoretisk kan man utvikle et antibiotikum som er meget effektivt mot gramnegative bakterier og som samtidig fjerner endotoksin fra blodbanen.
I flere laboratorier konstruerer man nå mindre peptider for eventuelt å kunne bruke dem til oral behandling. Samtidig må peptidene ha gode farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaper. Arbeid med dette foregår flere steder, men det er fortsatt et stykke frem før man eventuelt kan ha produkter på markedet.
Kryssresistens . En bekymring med disse stoffene er at de er en viktig del av det uspesifikke immunsystemet. Selv om det har vist seg å være vanskelig å indusere resistens mot disse antimikrobielle peptidene i laboratoriet, vil en resistensutvikling under klinisk behandling kunne ha uante effekter. Det er sannsynlig at resistens mot antibakterielle peptider gitt terapeutisk kan medføre kryssresistens mot kroppens egne defensiner. Resultatet kan bli at mikrobene blir resistente mot viktige deler av vårt immunforsvar. Det er derfor denne forfatters mening at det vil være en fordel dersom man kan utvikle peptidantibiotika som har strukturer som er forskjellige fra de naturlig forekommende peptidene. Samtidig bør de inneha de gode egenskapene disse stoffene har – rask, ikke-toksisk nedbrytning i naturen, lav, om noen resistensutvikling og hurtig bakteriedrap med lav toksisitet.
