Tiopurinene ble oppdaget og tatt i klinisk bruk for 50 år siden (1) I Norge er det nå to tiopuriner i klinisk bruk: azatioprin (AZA; Imurel) og 6-merkaptopurin (6-MP; Puri-Nethol). Det viktigste indikasjonsområdet for AZA, som er en prodrug til 6-MP, er immunsuppresjon ved organtransplantasjoner, mens 6-MP anvendes i kombinasjon med metotreksat til vedlikeholdsbehandling av akutt lymfatisk leukemi hos barn. Her i landet er azatioprin dessuten godkjent til bruk ved inflammatoriske autoimmune sykdommer, for eksempel Crohns sykdom og ulcerøs kolitt (2).
Tiopuriner brukes ved tilstander der det tar tid (måneder) før man kan evaluere ønskede kliniske effekter og bivirkninger (3). De alvorligste bivirkningene, slik som beinmargshemming, er potensielt livstruende. Avstanden mellom en dose som gir ønsket klinisk effekt og en dose som gir livstruende bivirkninger, er liten. På grunn av interindividuelle variasjoner i metabolismen av tiopuriner kan en og samme dose være subterapeutisk for en pasient og livstruende for en annen. Inntil for få år siden ble tiopurinbehandling utelukkende styrt på grunnlag av tellinger av leukocytter og blodplater og av kliniske funn, noe som tidligst gir mulighet for korrigering av dosen ca. en uke etter behandlingsstart. Man ønsket seg derfor diagnostiske tester som kunne forutsi den enkelte pasients evne til tiopurinmetabolisme.
I denne artikkelen vil vi gi en oversikt over ny viten innen feltet farmakogenetikk som ligger til grunn for utviklingen av mer rasjonell tiopurinterapi (4).
Metabolisme og virkningsmekanismer
Tiopurinene er antimetabolitter og følger samme metabolismeveier som endogene puriner (fig 1) (3).
Figur 1 De viktigste intracellulære metabolismeveiene for tiopuriner. Det stripete området markerer katabolske og/eller detoksifiseringsruter som inaktiverer tiopurinene fra inkorporering i nukleinsyrene DNA og RNA. Det ikke-stripete området dekker anabole metabolismeveier som fører til aktivering av tiopurinene via enzymet hypoxantin-guanyl-ribosyl-transferase (HGPRT) og inkorporering i nukleinsyrene DNA og RNA, hovedårsaken til at tiopurinene har cytotoksisk effekt (AO, aldehydoksidase; DNA, deoksiribonukleinsyre; GD, guanindeaminase; GMPS, guanylat-monofosfat-syntetease; IMPD, inosinmonofosfat-dehydroksylase; 6-MMP, 6-(S-metyl)merkaptopurin; 6-MP, 6-merkaptopurin; MTG, 6-(S-metyl)tioguanin; 6-MTGMP, 6-(S-metyl)tioguanosin monofosfat; 6-MTIMP, 6-(S-metyl)tioinosin monofosfat; 8-OH-6-MP, 8-hydroksy-6-merkaptopurin; 8-OH-TG, 8-hydroksy-tioguanin; RNA, ribonukleinsyre; 6-TdGTP; 6-tiodehydroksyguanosin trifosfat; 6-TG, 6-tioguanin; 6-TGDP, 6-tioguanosin difosfat; 6-TGMP, 6-tioguanosin monofosfat; 6-TGN, 6-tioguanin nukleotider; 6-TGTP, 6-tioguanosin trifosfat; 6-TIMP, 6-tioinosin monofosfat; TPMT, tiopurin metyltransferase; 6-TX, 6-tioxantin; 6-TXMP; 6-tioxantosin monofosfat; TUA, 6-tiourinsyre; XO, xantinoksidase.)
Den første metabolismeveien for 6-MP er ribofosforylering ved enzymet hypoxantin-guanin-fosforibosyl-transferase (HGPRT), som gir 6-TGN, en gruppe aktive metabolitter som inkluderer mono-, di- og trifosforylerte ribo- og deoksyribonukleotider av 6-tioguanin. I celler med cellekjerne vil 6-TGN bli inkorporert i DNA og RNA som falske nukleotider og representerer på den måten det aktive prinsipp (5).
Den andre metabolismeveien for 6-MP er metylering ved tiopurinmetyltransferase (TPMT), som gir vesentlig inaktive, men også noen aktive metabolitter (fig 1). Forbruket av metyldonoren S -adenosylmetionin ved metylering av tiopuriner kan føre til hypometylering av DNA, hvilket igjen kan gi endringer i transkripsjon av gener og påvirke cellereplikasjon (5). Både 6-MP og metylerte tiopurinmetabolitter kan for øvrig hemme de novo purinribonukleotidsyntese via feedbackkontroll (5) eller påvirke ATP- og GTP-konsentrasjoner (6), med de følger dette kan ha for celleveksten.
Den tredje metabolismeveien, oksidasjon av 6-MP til tiourinsyre ved xantinoksidase, er en inaktiverende metabolismevei (fig 1). Enzymet har høyest aktivitet i tarm og lever (3), en lokalisering som fører til høy ”first-pass”-effekt (det vil si metabolisme av legemidlet i lever før det når systemisk kretsløp) og følgelig lav biotilgjengelighet av tiopuriner gitt oralt.
TPMT – et nøkkelenzym
Metylering av 6-MP via TPMT og ribofosforylering via HGPRT av tiopuriner er konkurrerende metabolismeveier (fig 1). Det er vist sammenheng mellom TPMT-aktivitet og klinisk resultat av tiopurinbehandling (3), og kunnskap om TPMT og dets funksjon blir derfor viktig når det gjelder forståelse av det kliniske resultatet av tiopurinbehandlingen.
Biokjemiske egenskaper
TPMT (EC 2.1.1.67) er et S-adenosyl-L-metionin (AdoMet)-avhengig cytoplasmatisk enzym som fortrinnsvis katalyserer S-metylering av aromatiske og heterosykliske sulfhydrylforbindelser, som tiopurinene 6-MP, AZA og 6-TG (7). En relativt bred substratspesifisitet og det forhold at ingen endogene substrater er kjent for TPMT, gjør at dets prinsipielle biologiske rolle fremstår som en generelt detoksifiserende, liksom andre xenobiotikametaboliserende enzymer (7). TPMT er påvist i de fleste humane vev. TPMT-aktiviteten i røde blodceller korrelerer godt med aktiviteten av enzymet i andre vev, noe som gjør erytrocytter egnet for måling av denne enzymaktiviteten hos mennesker. Videre vil 6-TGN være de metabolske endeproduktene av tiopuriner i celler uten cellekjerne. De vil blant annet akkumuleres i erytrocytter, noe man alternativt kan benytte seg av ved terapeutisk monitorering av 6-MP.
Genetisk polymorfisme
Aktiviteten av TPMT viser store interindividuelle variasjoner og er kontrollert bl.a. ved genetisk polymorfisme. Flere store populasjonsstudier har vist en trimodal frekvensdistribusjon av TPMT-aktivitet i erytrocytter. Weinshilboum & Sladek viste at 88,6 % av befolkningen hadde høy TPMT-aktivitet, 11,1 % intermediær aktivitet og 0,3 % (én av 300 individer) ingen påviselig aktivitet (8). Familiestudier har bekreftet at TPMT-aktiviteten nedarves som en autosomal kodominant egenskap.
Genet for TPMT, som er klonet og lokalisert til kromosom 6p22.3 (9), har en størrelse på 34 kilobaser. Det består av ti eksoner og ni introner og koder for et lite protein med 245 aminosyrer. Det er inntil nå rapportert 13 ulike TPMT-alleler, hvorav 11 muterte alleler er assosiert med nedsatt TPMT-aktivitet (10).
Figur 2 viser forskjellige alleler. Alle unntatt villtype (wt)-alleler og alleler med stille mutasjoner gir opphav til ikke-funksjonelt protein eller gjør at proteinet blir tilgjengelig for proteolytisk aktivitet (10). Transkripsjon og translasjonshastigheter for TPMT * 2 -, * 3A -, * 3B - og * 3C -allelene er sammenliknbare med wt-allelet, men proteinet som kommer fra de muterte allelene, har kortere halveringstid og dermed lavere TPMT-aktivitet. I USA og Europa er de vanligste muterte TMPT-allelene TPMT * 3A- , * 3C - og *2 (fig 2). I Afrika og Asia, liksom i den samiske befolkning, er * 3C -allelet det vanligste (10, 11).
Figur 2 er en skjematisk fremstilling av TPMT-genet og dets mutasjonsspektrum. Boksene, som representerer eksoner, er nummerert med romertall. Størrelsen på boksene, her angitt som antall baser inne i boksen, er proporsjonal med de reelle lengdene. Fargekoder; hvit: ikke-translatert område; rødt: translaterte områder som ikke inneholder mutasjoner; rosa: translaterte områder som kan inneholde mutasjoner; grønt: intron. Bare mutasjoner som endrer proteinstruktur, for eksempel endring i proteinets primærsekvens eller peptidlengde, er inkludert. Alle mutasjonene er enkle nukleotidtransisjoner. Nukleotid- og aminosyrenummerering korresponderer med henholdsvis posisjon i mRNA åpen leseramme (ORF) og proteinets primærsekvens. Lengden på intron varierer fra flere hundre til tusen basepar, selv om de her er tegnet like lange
I promotorregionen i 5” ende av TPMT-genet finner man i tillegg en annen type genetisk polymorfisme (12) forårsaket av et ”variabelt antall tandemrepetisjoner” (VNTR), varierende fra fire til åtte repeterende enheter. Hver repeterende enhet består av 17 eller 18 basepar og inneholder et potensielt bindingssted for transkripsjonsfaktoren Sp 1. Det er vist en negativ korrelasjon mellom det totale antall repeterende enheter og TPMT-aktivitet.
Ikke-genetiske faktorer som påvirker TPMT-aktivitet
TPMT-aktivitet varierer også med faktorer som kjønn, alder, kronisk sykdom, etnisk bakgrunn og legemiddelbruk (3 – 5). I noen studier har man ikke klart å påvise kjønnsforskjell i TPMT-aktivitet, i andre er det vist at menn har en høyere enzymaktivitet enn kvinner (13). Det er 50 % høyere aktivitet hos nyfødte i forhold til hos voksne, og ca. 10 % høyere aktivitet hos barn under fem år i forhold til dem over fem år. Kronisk sykdom som uremi er blitt forbundet med høy TPMT-aktivitet (14). I kliniske studier er det indikasjoner på at 6MP og azatioprin induserer aktiviteten av TPMT, mens TPMT-aktiviteten varierer lite over tid hos friske frivillige individer (15). Langtidsbehandling med diuretika øker aktiviteten av TPMT (16), mens akutt in vitro-hemming er observert med de samme substansene i erytrocytter in vitro (17). En rekke farmaka hemmer TPMT-aktiviteten, deriblant salisylsyre, sulfasalazin, S-adenosylhomocystein og sinefungin (18).
Aktuelle metoder for predikering av evne til tiopurinomdanning
Fenotyping av TPMT
Fenotyping av TPMT gjøres ved å bestemme TPMT-aktiviteten i erytrocytter isolert fra helblod (19). Denne prosedyren er tidkrevende og er uegnet dersom pasienten har fått blodoverføring i løpet av de 2 – 3 siste månedene (10).
Genotyping
Kunnskap om sammenheng mellom mutasjoner og enzymaktivitet gjør det mulig å forutsi pasientens individuelle metaboliseringskapasitet. Påvisning av A719G-mutasjonen, som er felles for både TPMT *3A (A719G og G460A) og -* 3C (A719G), identifiserer 100 % av den delen av en samisk og ca. 90 % av en hvit kaukasisk befolkning som må ha lavere tiopurindoser enn øvrige 90 % av de respektive befolkningene for å unngå alvorlig beinmargshemming (11).
Genotyping er enklere å utføre enn fenotyping. Det kreves 1 µ l DNA, som tilsvarer 100 µ l helblod. Metoden er rask og billig og resultatet er ikke påvirket av blod fra tidligere transfusjoner.
Måling av intracellulære metabolitter
Rasjonalet for måling av 6-TGN er at inkorporering i målcellenes DNA utgjør et første trinn i virkningsmekanismen for tiopuriner (fig 1) og er relatert til effekt/bivirkning. 6-TGN er det metabolske endeproduktet i celler uten cellekjerne, og kan måles i erytrocytter (20).
TPMT er sentral i metabolismen av tiopuriner på ulike nivåer i metabolismekartet (3) (fig 1), og både 6-MP-, 6-TG- og 6-MP-nukleosider og nukleotider er substrater for TPMT. Metylerte metabolitter er dels inaktive og dels aktive, blant annet i hemming av de novo-purinsyntese (5). Intracellulære metylerte 6-MP-metabolitter (6MMP) kan måles ved hjelp av ulike høytrykksvæske kromatografiske (HPLC) metoder etter hydrolyse av cellelysat (20).
Styring av tiopurindosering ved akutt lymfatisk leukemi
Peroralt 6-MP benyttes i ambulant vedlikeholdsbehandling av akutt lymfatisk leukemi etter oppnådd remisjon (21). En standarddose av 6-MP gir uttalt og langvarig nøytropeni og dermed dårlig behandlingsresultat hos pasienter med lav TPMT-aktivitet (21). Pasienter med intermediær TPMT-aktivitet utgjør ca. 10 % av befolkningen, noe som tilsier at det vil være lønnsomt å gjøre TPMT-fenotyping eller -genotyping før behandling av barn med akutt lymfatisk leukemi.
Det er vist at plasma-6-TGN-verdier> 275 pmol 8 × 10 − ⁸ i erytrocytter gir betydelig leukopeni (22). En alternativ strategi i forhold til feno- eller genotyping før behandling vil derfor være å gi en testdose 6-MP med påfølgende måling av 6-TGNnivåer for å unngå beinmargshemming. Pasienter med lav eller intermediær TPMTaktivitet vil da ha høye 6-TGN-verdier, fordi mindre tiopurin går langs den konkurrerende metabolismeveien. Dette gjelder også pasienter som får behandling med 6-tioguanin (ikke registrert i Norge), ettersom dette også er substrat for TPMT (23).
Det er viktig at man også tar hensyn til en variasjon på opptil 5 – 7 ganger i TPMT-aktivitet innen gruppen individer med høy aktivitet (21). Fenotyping av TPMT i erytrocytter gir i så måte et øyeblikksbilde av TPMT-aktiviteten hos pasienten.
Videre vil dosering av 6-MP til pasienter innen de respektive gruppene høy, intermediær og lav med hensyn på TPMT-aktivitet også kunne veiledes ved bestemmelser av erytrocyttnivå av 6-MP-metabolitter. Måling av både 6-TGN og 6-MMP er den beste måten å teste om legemidlet 6-MP er inntatt, dvs. som kontroll av etterlevelse (compliance) (24).
Det er rapportert en mulig sammenheng mellom lav TPMT-aktivitet og høye nivåer av 6-TGN og metylerte metabolitter etter 6-MP-behandling av pasienter med akutt lymfatisk leukemi som senere har utviklet hjernetumorer (25), akutt myelogen leukemi og myelodysplasi.
I en felles nordisk protokoll har man også sett at dersom metotreksat (MTX) og 6-MP gis samtidig, vil metotreksat forsterke omdanningen av 6-MP til aktive metabolitter, samtidig som de to medikamentene gjensidig forsterker hverandres effekt på celler i deling.
Styring av tiopurindosering ved nyretransplantasjoner
Standard trippelbehandling ved nyretransplantasjon har lenge vært ciklosporin, steroider og azatioprin (26). Azatioprin omdannes raskt til 6-MP in vivo. Ved fenotyping og genotyping av TPMT identifiseres pasienter som trenger betydelig dosereduksjon av azatioprin. Farmakokinetikken til stoffet ved nyretransplantasjonskirurgi karakteriseres for øvrig av betydelig interindividuell og intraindividuell variabilitet. Det er derfor behov for teknikker utover TPMT-tester for å styre doseringen.
Styring av tiopurindosering ved behandling av andre tilstander
Hos hjertetransplanterte (27), hos pasienter med revmatologiske lidelser, inflammatorisk tarmsykdom (28), dermatologiske (29) og hematologiske lidelser (22) er det også vist en sammenheng mellom høy TPMT-aktivitet og betydelig beinmargshemming ved standard azatioprindosering. Hos pasienter med inflammatoriske tarmsykdommer er TGN-nivå> 235 pmol per 8 × 10 − ⁸ erytrocytter forbundet med bedret
Konklusjon
Tiopurinterapi styres i dag primært ved hjelp av klinisk bilde, måling av nøytrofile granulocytter og blodplater. Genotyping eller fenotyping av TPMT vil kunne identifisere en liten, men viktig gruppe pasienter som må ha betydelig dosereduksjon for å unngå uttalt beinmargshemming. Testing bør derfor gjøres før start av tiopurinbehandling. Ytterligere optimalisering av behandlingen kan oppnås ved monitorering av intracellulære erytrocytt-purinmetabolitter, hvilket i tillegg kan fungere som en viktig kontroll av pasientetterlevelse.
