Oppdagelsen av virus som forårsaker luftveisinfeksjoner skjedde for det meste i 1950- og 60-årene med celledyrking, elektronmikroskopi og immunologiske metoder. Man har identifisert en lang rekke virus, bl.a. influensavirus, parainfluensavirus, respiratorisk syncytialt virus (RSV), rhinovirus og coronavirus som gir luftveisinfeksjoner fra rhinitt til pneumoni. Ved mange luftveisinfeksjoner med antatt viral årsak har man ikke kunnet påvise det utløsende agens. Man har derfor postulert at ikke alle virus som forårsaker luftveisinfeksjoner, er oppdaget (1 ). Genteknologiske metoder har vært et viktig redskap ved siden av tradisjonelle virologiske metoder for å oppdage nye virus, som for eksempel hepatitt C-virus (1989) og SARS-coronavirus (2003). Genteknologiske metoder ble også benyttet ved oppdagelsen av humant metapneumovirus (hMPV) (2 ).
Oppdagelsen og karakteriseringen
Humant metapneumovirus ble oppdaget ved en tilfeldighet. Hoogen og medarbeidere hadde observert cytopatogen effekt i cellekulturer som var blitt stående i 10 – 14 dager, dvs. betydelig lenger enn vanlig for diagnostiske formål. Man kunne ikke identifisere noe kjent agens. Den observerte cytopatogene effekten liknet mest på respiratorisk syncytialt virus. Man gikk videre med elektronmikroskopiske undersøkelser og fant paramyxovirusliknende partikler. For å bekrefte funnet av et nytt virus, brukte man en polymerasekjedereaksjonsbasert metode med tilfeldige primere og sekvensering av de resulterende genproduktene. Sekvensene passet ikke med noen hittil kjente virus i gensekvensdatabaser.
Hoogen og medarbeidere hadde samlet nærmere 30 virusisolater med stor sekvenslikhet og identifiserte disse som en ny spesies. Nærmeste beslektede art var aviært pneumovirus, som gir luftveisinfeksjoner hos kalkun. Det er den eneste kjente spesies i genuset metapneumovirus utenom humant metapneumovirus. Taksonomisk tilhører humant metapneumovirus familien paramyxoviridae, subfamilie pneumovirinae, genus metapneumovirus. Nærmeste beslektede humanpatogene virus er respiratorisk syncytialt virus som tilhører den samme subfamilien. Alle de nærmeste slektningene til humant metapneumovirus har luftveispatogene egenskaper (fig 1).
Fylogenetisk slektskap: Familien Paramyxoviridae inndeles i to subfamilier, pneumoviridae og paramyxoviridae. Boksene representerer ulike genus med relevante humanpatogene spesies. Forgreningenes lengde representerer ikke den relative fylogenetiske avstanden
Humant metapneumovirus er et kappekledd virus med enkelttrådet RNA med negativ polaritet. Genomet på vel 13 000 baser er fullstendig sekvensert (3 ). Den genetiske organiseringen av humant metapneumovirus følger det vanlige mønsteret for paramyxovirus. De første publikasjonene beskrev to serotyper, senere artikler omtaler fire hMPV-genotyper (4 , 5 ).
Publiserte data
Etter den første rapporten er det kommet en rekke publikasjoner som omhandler humant metapneumovirus. Man vet at viruset forårsaker en luftveisinfeksjon som kan være begrenset til de øvre luftveiene, men som også kan gi bronkiolitt og pneumoni. Cytologi fra materiale fra bronkioalveolær lavage og lungebiopsier fra hMPV-infiserte pasienter viser at viruset affiserer luftveisepitelceller direkte og fører til henfall, nekrose, nøytrofil respons og økt slimproduksjon (6 ). Man har eksponert makakeaper for humant metapneumovirus og funnet inflammatoriske forandringer i mucosa og submucosa. Virus ble hovedsakelig påvist i ciliaepitelcellene. Apene skilte ut virus fra dag 2 etter eksponeringen, hadde den høyeste utskillelsen dag 4, før denne gradvis avtok mot ca. dag 10 (7 ).
Humant metapneumovirus rammer en litt eldre gruppe enn respiratorisk syncytialt virus, dvs. 1 – 2-åringer hyppigere enn ettåringer (8 – 10 ). Man mener at ca. 5 – 7 % av alle luftveisinfeksjoner hos innlagte barn skyldes humant metapneumovirus (11 ), men andelen kan være mye høyere i en utbruddssituasjon som beskrevet i Trondheim. Infeksjoner forårsaket av humant metapneumovirus fremkaller tilsynelatende en svakere cytokinrespons enn respiratorisk syncytialt virus og influensavirus (12 ). Personer med svekket immunforsvar har alvorligere forløp også ved reinfeksjon, noe som illustreres ved at de eneste rapporterte dødsfallene med humant metapneumovirus rammet sterkt immunsvekkede pasienter (13 , 14 ). Reinfeksjoner med humant metapneumovirus hos eldre kan gi betydelige luftveissymptomer, i likhet med respiratorisk syncytialt virus (10 , 15 ).
Diagnostikk
Den eneste rutinediagnostiske metoden for påvisning av humant metapneumovirus på det nåværende tidspunkt er polymerasekjedereaksjon (PCR). Avdelingen vår utviklet en sanntid (real-time)-PCR for hMPV-påvisning høsten 2002. Den baserte seg på de sekvensene som var tilgjenglig på det tidspunktet (16 ). Primerne og TaqMan-proben er senere blitt forandret for å samsvare med nyere sekvenser i tråd med publiserte data (5 ). Aktuelt prøvemateriale er nasopharynxaspirat hos små barn. Hos eldre barn og voksne kan dyp neseprøve eller halsprøve benyttes. I spesielle tilfeller kan materiale fra de nedre luftveier være aktuelt. I rutinediagnostikken ved St. Olavs Hospital er humant metapneumovirus en del av «luftveispakken» som benyttes for å screene prøver fra barn innlagt med akutte luftveissymptomer.
van den Hoogen et al. benyttet en tertiær apenyrecellelinje til dyrking av humant metapneumovirus. Denne cellelinjen er ikke tilgjengelig utenfor Nederland. Andre tertiære apenyrecellelinjer er derimot tilgjengelig for diagnostisk bruk, men ser ut til å være dårligere egnet enn den hollandske. Den mest kjente er LLC-MK2 som brukes av de fleste mikrobiologiske laboratorier som dyrker luftveisvirus. Mange publikasjoner som omhandler dyrking av humant metapneumovirus i cellekultur beskriver at de ikke opplever cytopatogen effekt. Man konfirmerer i stedet vekst av viruset med en PCR-analyse utført på cellekulturmateriale.
Indirekte immunflourescens ved hjelp av polyvalente kaninantistoffer som er utviklet ved vår avdeling ser ut til å gi gode resultater på cellekultur (fig 2). Anvendt direkte på prøvemateriale, er sensitiviteten ca. 50 % sammenliknet med resultatene ved polymerasekjedereaksjon. Bruken av metoden direkte på prøvemateriale fra nasopharynx har vært lovende og vil bli validert for klinisk bruk. Viruset lar seg også påvise ved hjelp av elektronmikroskopi fra cellekulturer (fig 3). Sekvensering av stammer isolert i Trondheim viser at utbruddet i 2002 – 03 ble forårsaket av genotype A1 mens stammer fra vintersesongen 2004 – 05 tilhører genotype B2. Vi har også observert at B2-stammene av og til gav cytopatogen effekt i noen av våre cellelinjer (syncytiedanning), mens stammer tilhørende genotype A1 ikke gav synlige celleforandringer i det hele tatt.
Figur 2 LLC-MK2-cellekultur infisert med humant metapneumovirus. Indirekte immunflourescenspåvisning med polyklonalt anti-hMPV-serum fra kanin
Figur 3 Elektronmikroskopisk bilde av hMPV-partikler i celledyrking (52 800 x forstørret, Are B. Dalen, 2003)
Serologiske undersøkelser
Serologiske undersøkelser har vist at humant metapneumovirus er et svært vanlig virus. De fleste blir infisert i ung alder. I 6 – 12-månedersalderen har allerede 25 % av de undersøkte antistoffer mot viruset, og ved femårsalderen er nesten alle seropositive (2 , 17 , 18 ). Dette tyder på at en vesentlig del av infeksjonene med humant metapneumovirus forløper subklinisk. Undersøkelser av nedfrosne sera fra 1958 har vist 100 % seroprevalens (alder 8 – 99 år), hvilket betyr at dette ikke er et nytt virus (2 ). Viruset etterlater sannsynligvis en ufullstendig immunitet, slik at reinfeksjoner er mulig (19 ).
Ved vår avdeling er det utviklet en helvirus ELISA-test for påvisning av IgG- antistoffer mot humant metapneumovirus. Undersøkelser gjort på eget materiale våren 2003 tyder på at prevalensen i Norge likner den nederlandske (data ikke vist). Serologiske tester for rutinediagnostikk er foreløpig ikke kommersielt tilgjengelig.
Konklusjon
Humant metapneumovirus er et av de viktigere luftveisvirus etter influensa og respiratorisk syncytialt virus. Påvisning av viruset med polymerasekjedereaksjon er den eneste etablerte rutinemetoden. Aktuelt prøvemateriale er først og fremst nasopharynxaspirat hos små barn og nese- eller halspenselprøver hos alle andre. Serologiske tester er ennå ikke tilgjenglig for rutinediagnostikken. Viruset er vanlig og kan til og med være det dominerende luftveisagens i en utbruddssituasjon (20 ). Reinfeksjoner forekommer. Påvisning av humant metapneumovirus bør derfor bli en del av rutinerepertoaret til mikrobiologiske avdelinger som betjener barneavdelinger.
