Cytostatikadosering etter farmakogenomiske markører eller kroppsoverflate?

Enzymreaksjoner

Fase 1-reaksjoner innebærer oksidasjon, reduksjon eller hydrolyse, som gjør legemidlene mer polare og dermed mer vannløselige. Dette gir økt utskilling av legemidlet via nyrene. Oksidasjon er den vanligste formen for fase 1-reaksjon, og de fleste oksidative legemiddelreaksjoner katalyseres av cytokrom P-450-oksidaser. Det er flere hundre cytokrom P-450-isoformer. Noen er konstitutivt uttrykt og noen induseres av eksogene kjemiske forbindelser. De viktigste isoformene for legemiddelomsetning er CYP2D6, CYP2C9, CYP3A4 og CYP3A5, og det er betydelig overlappende substratspesifisitet mellom de to sistnevnte.

Fase 2-reaksjoner omfatter konjugering eller enzymatisk påkobling av hydrofile grupper til legemidlet eller metabolitten (glukuronidering, acetylering, glutationkonjugering, sulfatkonjugering). Konjugatene er vanligvis mer vannløselige enn fase 1-metabolittene og skilles enda lettere ut i urin. Som oftest er konjugatene mindre farmakologisk aktive enn morsubstansen. Det foreligger også multiple isoformer av konjugerende enzymer. Genetisk polymorfisme bidrar til betydelig variasjon i både fase 1- og fase 2-reaksjoner.

Aktivering og metabolisme

Topoisomerase I-hemmeren irinotecan, som særlig brukes ved tykktarmskreft, er et ikke-aktivt legemiddel som omdannes av karboksylesterase til den aktive metabolitten SN-38. Enzymet UDP-glukuranosyltransferase 1A1 (UGT1A1) konjugerer SN-38 til et inaktivt glukuronid som først og fremst skilles ut via galle (fig 1). Det er påvist stor variasjon i ekspresjon av dette mikrosomale leverenzymet og inntil 50 ganger forskjell i glukorinideringshastighet for SN-38 ulike pasienter imellom (6). UGT1A1-genet har flere variantalleler som er assosiert med redusert SN-38-glukuronidering og økt toksisitet (3). Det er nå gode holdepunkter for å anta at genotyping av UGT1A1 kan predikere toksisitet, og det er vist at bærere av A3156A- eller UGT1A1*2-variantene er særlig utsatt for alvorlig beinmargssuppresjon og antakelig bør ha reduserte doser av irinotecan (3). Imidlertid må en slik doseringsstrategi verifiseres gjennom prospektive kliniske studier.

Genetisk polymorfisme av UGT. Allelet UGT1A1*2 er forbundet med redusert inaktivering av SN-38, den aktive metabolitten av irinotecan. Dette fører til redusert utskilling via gallen og følgelig økt antitumoraktivitet og økt toksisitet

Enkelte pasienter kan bli utsatt for livstruende beinmargstoksisitet etter behandling med merkaptopurin eller azatioprin (som omdannes til merkaptopurin etter tilførsel). Merkaptopurin (6-MP) aktiveres intracellulært av fosforibosyltransferase (HPRT) til tioguaninnukleotider, som binder seg til DNA og hemmer nukleinsyresyntesen (fig 2). Denne effekten motvirkes av et annet enzym, tiopurinmetyltransferase (TPMT), som metylerer merkatopurin til en inaktiv metabolitt. I befolkningen generelt finnes TPMT i ulike varianter med ulik aktivitet: Hos 89 – 90 % er det høy aktivitet, hos 10 % intermediær aktivitet og hos 0,3 – 0,6 % liten eller ingen aktivitet (7, 8). Dette skyldes i hovedsak genetisk variasjon i tre alleler (TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3C), og pasienter som er homozygote for disse, vil utvikle meget alvorlig og potensielt dødelig beinmargstoksisitet samt ha økt risiko for sekundær kreftutvikling (9). På den annen side er det vist at barn med høy TPMT-aktivitet har lave tioguaninnivåer intracellulært og høyere residivfrekvens av akutte leukemier (10). Pasientenes fenotype kan bestemmes med en prøvedose 6-MP ved å analysere nivået av 6-tioguaninnukleotider (6-TGN) i kjerneløse røde blodceller. Genotyping er imidlertid enklere å utføre enn fenotyping og krever minimalt med prøvemateriale, ikke mer enn 100 µl helblod. TPMT-genotyping av 18 variantalleler er vist å gi 98 % samsvar med TPMT-enzymaktivitet, og kan forutsi TPMT-fenotype med 90 % sensitivitet og 99 % spesifisitet (8). TPMT-genotyping bør derfor være egnet som rutineanalyse før behandling med merkaptopurin, da homozygote bærere av varianter med TPMT-svikt vil ha behov for 80 – 90 % dosereduksjon for å unngå eksessiv toksisitet.

Genetisk polymorfisme av TPMT. Allelene TPMT*2, TPMT*3A, TPMT*3C er forbundet med redusert inaktivering av merkaptopurin (6MP), som fører til flere tioguaniner (6-TG) tilgjengelig for interaksjon med DNA og økt cytotoksisk effekt

Cyklofosfamid og ifosfamid er oxazoforiner som i seg selv er inaktive substanser, men som aktiveres hovedsakelig i lever til alkylerende 4-hydroksy-metabolitter (fig 3) av ulike enzymer fra de tre CYP-subfamilene 3A, 2B og 2C (11, 12). Hos menneske synes CYP2B6 å være viktigste isoenzym for aktivering av cyklofosfamid og CYP3A4 viktigst for aktivering av ifosfamid (13). Det er tidligere vist at sammensetningen av P-450-leverenzymer har stor betydning for omsetningen av cyklofosfamid og ifosfamid i dyremodeller (14), og dette kan muligens også være forklaringen på de store individuelle forskjellene i oxazoforinmetabolismen som er observert hos mennesker (15). Det er identifisert funksjonelle variantalleler av CYP2B6 (16) og CYP3A4 (17), men deres innvirkning på omsetningen av oxazoforiner er ikke undersøkt. Imidlertid har eksperimentelle forsøk vist at humane variantalleler av CYP2C9 og CYP2C19 kan medføre betydelig variasjon (inntil seks ganger) i bioaktiveringen av ifosfamid og cyklofosfamid (12). Med andre ord foreligger det potensielt viktige polymorfismer innen alle CYP-isoformer som er involvert i oxazoforinaktiveringen, men betydningen av disse for tumorkontroll, overlevelse og toksisitet er så langt ikke kartlagt.

Genetisk polymorfisme av DPD. Allelvarianten DPYD*2A er forbundet med redusert inaktivering av 5-fluorouracil (5-FU), som gjør mer 2’-deoksytymidin-5’-monofosfat (dTMP) tilgjengelig for interaksjon med DNA og økt cytotoksisk effekt

Etter aktivering av oxazoforinene innstilles en likevekt mellom 4-hydroksymetabolittene og aldofosfamid, som inaktiveres til karboksyfosfamid av aldehyddehydrogenase (ALDH), særlig isoenzymene ALDH1, ALDH3 og ALDH5 (fig 3). I celleforsøk er det vist at den toksiske effekten av cyklofosfamid er omvendt proporsjonal med cellenes innhold av ALDH (18), hvilket viser hvor viktig karboksylering av aldofosfamid er for effekten av cyklofosfamid. Genetisk polymorfisme, som er beskrevet for flere av ALDH-isoenzymene (19), vil kunne bidra til variasjon i nedbrytningen av cyklofosfamid og forklare observerte individuelle forskjeller i karboksylering hos pasienter som behandles med cyklofosfamid (20). Imidlertid er det hittil ikke vist at ALDH-polymorfisme virker inn på effekt og sikkerhet av oxazoforiner, men at slik polymorfisme kan ha stor terapeutisk betydning, er nylig vist ved at visse variantalleler av ALDH2 medfører betydelig redusert effekt av glyseroltrinitrat i deler av den asiatiske befolkingenen (21).

Antimetabolitten 5-fluorouracil fungerer som en falsk pyrimidinbase som fosforibosyleres intracellulært til aktive nukleotider (FdUMP, FdUTP, FUTP). Dihydropyrimidindehydrogenase (DPD) omdanner 5-fluorouracil til den inaktive metabolitten dihydro-5-fluorouracil (fig 4). Det er beskrevet mer enn 39 varianter av genet som koder for DPD, og en av disse, DPYP2A*, medfører DPD-mangel, redusert eliminasjon av 5-fluorouracil og alvorlig toksisitet hos pasienter med kolorektalkreft (22). Som alternativ til DPD-genotyping kan man måle ratio mellom uracil og dihydrouracil i plasma som funksjonelt uttrykk for DPD-aktivitet (23).

Genetisk polymorfisme av ALDH. Allelene ALDH1A, ALDH3A og ALDH5A er forbundet med redusert inaktivering av aldofosfamid, og dette fører til økt danning av fosforamid sennepsgass, som gir økt DNA-skade og har økt cytotoksisk effekt. I tillegg vil genetisk polymorfisme i aktiverende gener (CYP3A4, CYP2C9 og CYP2B6) kunne bidra til variasjon i danningen av aldofosfamid

Terapeutiske virkningsseter

Den terapeutiske virkningen av 5-fluorouracil er dels knyttet til at FdUMP hemmer enzymet thymidylatsyntetase (TS), et nøkkelenzym i DNA-syntesen. Derfor er den kliniske effekten av 5-fluorouracil assosiert med ekspresjonsnivået av thymidylatsyntetase, og interindividuell variasjon i TS-ekspresjon er assosiert med enkeltnukleotidpolymorfismer. Den genetiske varianten TSER*3 medfører relativt høy TS-ekspresjon og relativ resistens mot 5-FU ved rektalkreft (24). I den kaukasiske befolkningen er 38 % rapportert å være TSER*3-homozygote, mens hele 67 % er homozygote i den asiatiske befolkningen (25).

Metotreksat blokkerer enzymet dihydrofolatreduktase, som gir reduserte folater. Dette er intermediærsubstanser i nukleinsyresyntesen og substrat for enzymet 5,10-metylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR), som er viktig for replikasjon av DNA (26). Økt metotreksattoksisitet er assosiert med genetiske varianter av MTHFR. T667T-varianten (homozygot for tyrosin i posisjon 667) har lav enzymaktivitet. Pasienter med T667T-varianten er rapportert å være særlig utsatt for alvorlig toksisitet assosiert med metotreksat i adjuvant behandling av brystkreft (27). Det gjelder også immunsuppresjon av beinmargstransplanterte leukemipasienter (28). T677T-varianten, som har omtrent 30 % enzymaktivitet i forhold til C667C-varianten (homozygot for cystein i posisjon 667), forekommer hos 10 – 12 % av den kaukasiske og den asiatiske befolkningen, mens heterozygote med 60 % enzymaktivitet utgjør omtrent 40 % av befolkningen.

Transportmolekyler

Aktive transportmekanismer bidrar til selektiv distribusjon av cytostatika over biologiske lipidmembraner. Såkalte ABC-proteiner (ATP Binding Casette) utgjør den største og viktigste proteinfamilien som er involvert i membrantransport av cytostatika. Hos mennesker er det identifisert 48 ABC-gener, som koder for ulike transportproteiner. Felles for disse er at de binder ATP, skaffer energi ved hydrolyse av ATP og befordrer en aktiv, utadrettet membrantransport, som dels formidler biologisk signaloverføring og dels hindrer opphopning av toksiske forbindelser intracellulært, bl.a. cytostatika. Variasjon i lokalisering og substratspesifisitet blant de ulike ABC-proteinene avspeiler biologisk funksjon og betydning for omsetning av legemidler. ABC-proteiner er til stede i tarm, lever og nyre, og er dessuten sentrale elementer i blod-hjerne-barrieren, blod-testis-barrieren og placentabarrieren.

Transportmolekyler som er involvert i opptak, distribusjon og eliminasjon av cytostatika tilhører først og fremst subfamiliene ABCB, ABCC og ABCG (e-tab 1). Særlig stor oppmerksomhet er viet ABCB1 og ABCG2, som koder for henholdsvis Pgp (P-glykoprotein) og BRCP (Breast Cancer Resistance Protein), begge assosiert med multiresistens hos kreftpasienter og høy ekspresjon i stamceller, inklusive tumorstamceller (29). Pgp har affinitet til en rekke legemidler, ikke minst cytostatika (e-tab 1), og bidrar til å regulere opptak, distribusjon og eliminasjon av legemidler over biologiske mebraner i tarm, lever, nyre og blod-hjerne-barrieren (30 – 33). Transporten går alltid i samme retning: Ut av cellene til henholdsvis tarmlumen, galleganger, nyrenes samlerør og blodbanen (fig 5). Mange kreftceller uttrykker også Pgp, noe som kan føre til kjemoresistens ved at cytostatika fraktes ut av kreftcellene så den toksiske effekten avtar.

Genetisk polymorfisme av ABCB1 fører til endringer i ekspresjon og funksjon av Pgp. En enkeltnukleotidpolymorfisme på ekson 26 fører til 3 genetiske varianter (3435CC, 3435 CT, 3435TT) med forskjellig evne til membrantransport

Omfattende genetisk heterogenitet er beskrevet for både ABCB1 og ABCG2. Den best undersøkte enkeltnukleotidpolymorfismen er lokalisert i posisjon 3435 på ekson 26 av ABCB1 og er assosiert med variasjon i ekspresjon og funksjon av Pgp (34). Dette gjenspeiles i et klinisk materiale der 3435C-allelet er assosiert med kjemoresistens og redusert overlevelse ved akutt myelogen leukemi (35). Pasienter som uttrykker 3435C-allelet, synes å ha økt transportkapasitet for antleukemiske midler, deriblant antrasykliner (fig 4). Hvordan denne mutasjonen, som ligger i et stumt område av genet, kan gi slike effekter, er fortsatt uklart. Antakelig opptrer flere mutasjoner samtidig og danner haplotypevarianter av ABCB1, som derfor kan uttrykke forskjellig funksjonell aktivitet. Imidlertid er slike ABCB1-varianter hittil ikke identifisert.

Det er nylig vist at økt metotreksattoksisitet kan skyldes redusert eliminasjon pga. en DNA-variant som fører til utskiftning av aminosyren arginin med glycin i transportproteinet MRP2 (humant multiresistensprotein-2), som kodes av ABCC2-genet (36). MRP2 er uttrykt i proksimale nyretubuli, og er antakelig viktig for eliminasjon av metotreksat via urin. Variantallelet 412G i ABCC2-genet er assosiert med substrataffinitet, og selv heterozygote individer vil uttrykke et dysfunksjonelt transportprotein med redusert affinitet til metotreksat, som dermed elimineres mindre effektivt. Dette kan føre til alvorlig nefrotoksisitet ved høydosebehandling med metotreksat, til tross for alkalisering av urinen (36).

Diskusjon

Sekvenseringen av det humane genom har vist en enorm genomisk variasjon hos mennesker. Vi vet foreløpig svært lite om hva variantene betyr, hvilke som er viktige og ikke minst hvordan de virker sammen. I denne artikkelen har vi referert og diskutert enkeltnukleotidpolymorfismer i enzymer, transportmolekyler og virkningsseter relatert til et utvalg cytostatika. I studier av enkeltpolymorfismene er det vist at DNA-varianter fører til ulik omsetning, struktur og/eller ekspresjon av genproduktet. Noen enkeltnukleotidpolymorfismer kan føre til fatale bivirkninger ved administrering av et bestemt legemiddel, som f.eks. merkaptopurin i ordinære doser til pasienter med genetisk betinget TPMT-mangel. Likevel er det hittil identifisert få DNA-varianter som har en så sterk innvirkning på proteinet at én enkelt variant fører til radikalt endret legemiddelrespons eller toksisitet.

Betydningen av genomisk variabilitet for variasjon i legemiddeeffekter må hele tiden vektes mot andre faktorer som alder, kjønn, nyrefunksjon, leverfunksjon og spesielle fysiologiske tilstander som graviditet, interaksjoner med andre legemidler, andre sykdommer og ev. allergiske reaksjoner. Vi har nevnt eksempler på at enkeltnukleotidpolymorfismer uansett kan ha dramatisk betydning for legemiddelrespons, men vi vet lite om betydningen av haplotyper der ulike og hyppig forekommende enkeltnukeotidpolymorfismer opptrer sammen hos samme individ. Ofte bidrar flere enzymer til omsetningen av et legemiddel, og flere tansportmolekyler bidrar til opptak, distribusjon og eliminasjon. Flere enkeltnukleotidpolymorfismer kan derfor virke sammen ved å forsterke eller nøytralisere hverandre. Slike haplotyper er potensielt viktige biomarkører, og haplotypeundersøkelser kan vise seg å bli et nyttig supplement til identifikasjon av genotyper med avvikende respons på cytostatika.

Dosering av cytostatika til maksimal tolerabilitet er fortsatt et grunnleggende prinsipp ved medikamentell kreftbehandling. Grunnlaget for dosevalget er stort sett empirisk, og normalisering i forhold til kroppsoverflate skal sørge for individuell tilpasning. Riktignok foreligger det dokumentasjon for at størrelsen på kroppsoverflaten står i forhold til glomerulær filtrasjonsrate, blodvolum, basal metabolsk ratio og beinmargsreserve (37, 38), men dette kan bare i begrenset omfang reflektere legemiddelclearance og i enda mindre grad legemiddeleffekt. Likevel utgjør størrelsen på kroppsoverflaten det mest rasjonelle grunnlag vi kjenner for individtilpasset dosering, selv om denne doseringsstrategien reduserer interindividuell farmakokinetisk variasjon for kun 15 % av undersøkte nyere cytostatika (1). Da cytostatika har svært smal terapeutisk virkebredde, kan konsekvensen av over- eller underdosering fort bli dramatisk. Bare tett klinisk oppfølging av pasienten vil kunne korrigere for dette, men denne strategien er lite egnet til å forutsi langtidseffekter. Derfor må dagens kunnskap om genomisk variabilitet legges til grunn for videre utforskning av nye doseringsstrategier for cytostatika.

Det er hittil identifisert noen få enkeltnukleotidpolymorfismer med avgjørende funksjonell betydning for omsetning og effekt av cytostatika (TMTP, UGTA1, DPD, MTHFR), og bare TPMT-genotyping brukes i dag rutinemessig i tarapiforberedelser. Det finnes en rekke andre kandidater der betydningen av genetisk polymorfisme ikke er klarlagt. Vi trenger prospektive studier som kan vise om genotypetilpasset dosering gir sikrere og mer effektiv cytostatikabehandling. I tillegg bør det rettes spesiell oppmerksomhet mot pasienter der det er påfallende bivirkninger. Disse bør vurderes med tanke på genotyping av aktuelle variantalleler for at neste kur skal kunne optimaliseres. Inntil videre er imidlertid skreddersydd dosering etter kroppsoverflate fortsatt å foretrekke i de fleste situasjoner, ved siden av tradisjonell terapeutisk legemiddelmonitorering og tett klinisk oppfølging.