Kronisk lymfatisk leukemi (KLL) er den hyppigste formen for leukemi i vår del av verden. I en norsk studie fra siste halvdel av 1990-årene ble det antydet en insidens på nærmere 4/100 000 innbyggere/år og en mann-kvinne-ratio på 1,5, at median alder ved diagnosetidspunktet var 72 år og at 78 % av pasientene var asymptomatiske da (1). De kliniske forløpene ved kronisk lymfatisk leukemi er svært variable. Ytterpunktene er raskt progredierende sykdom som svarer dårlig på behandling og fører til døden i løpet av 2 – 3 år (5 – 10 % av pasientene) og indolent sykdom som aldri blir behandlingstrengende og unntaksvis går i spontan remisjon (2, 3).
Sykdomsstadium er en god variabel for sykdomsutbredelse og har prognostisk utsagnskraft på gruppenivå, men det har vist seg at det er lite egnet til å vurdere prognose på individnivå hos asymptomatiske pasienter. I løpet av de siste ti år har vi fått betydelig innsikt i patofysiologiske forhold, og flere biologiske markører har vist god prognostisk utsagnskraft hos enkeltpasienter ved diagnosetidspunktet. De best etablerte prognostiske markørene er mutasjonsstatus for genet som koder for den variable delen av immunglobulinets tunge kjede, VH-genet, som KLL-cellene bruker, cytogenetiske aberrasjoner og ekspresjon av CD38 på celleoverflaten (ramme 1) (4 – 7). Målet for den aktuelle studien var å kartlegge forekomsten av disse markørene ved diagnosetidspunktet i et uselektert norsk pasientmateriale.
Ramme 1
Median overlevelse fra diagnosetidspunktet ved ulike biologiske markører (4 – 7)
Umutert VH-gen – 95 måneder
Mutert VH-gen – 293 måneder
del(17p13) – 32 måneder
del(11q22) – 79 måneder
Trisomi 12 – 114 måneder
Ingen cytogenetiske avvik – 111 måneder
del(13q14) – 133 måneder
CD38-positivitet – 120 måneder
CD38-negativitet – lik alderstilpasset normalbefolkning
Materiale og metode
Pasientpopulasjon
Alle som ble diagnostisert med kronisk lymfatisk leukemi i perioden 1.10. 2007 – 31.12. 2009, ble invitert til å delta i studien. Pasientene ble informert om studien av behandlingsansvarlig lege og ble inkludert etter informert skriftlig samtykke. De etterspurte pasientdataene ble, sammen med ordinær kreftmelding, sendt til Kreftregisteret, som fungerte som sekretariat for studien. I de tilfellene Kreftregisteret mottok melding om et nytt tilfelle av kronisk lymfatisk leukemi uten at pasienten var inkludert i studien, ble legen som hadde sendt kreftmeldingen tilskrevet med anmodning om å forespørre pasienten om inklusjon. All kontakt med pasientene skjedde gjennom behandlingsansvarlig lege.
Studien var et samarbeidsprosjekt mellom Norsk selskap for hematologi og Kreftregisteret. Norske hematologer ble orientert om studien gjennom Norsk selskap for hematologi, og detaljert informasjon om studien var tilgjengelig på selskapets og på Kreftregisterets hjemmesider.
Studien var godkjent av regional komité for medisinsk forskningsetikk (REK S-06353b) og Datatilsynet (07/00254-2).
Diagnostiske kriterier
For å stille diagnosen kronisk lymfatisk leukemi var det nødvendig å dokumentere vedvarende klonal B-lymfocytose (≥ 5 · 10⁹/l) med en karakteristisk immunfenotype i henhold til internasjonale retningslinjer (8). Småcellet lymfocyttært lymfom (SLL) skiller seg kun fra kronisk lymfatisk leukemi ved fravær av leukemisk fenotype. Pasienter med klonal B-lymfocytose, men < 5 · 10⁹/l, lymfeknutesvulst og/eller splenomegali og karakteristiske histologiske funn i lymfeknute og/eller beinmarg ble inkludert under diagnosen småcellet lymfocyttært lymfom.
Sykdomsstadium ble bedømt etter Binets stadieinndeling (9). Den er basert på klinisk undersøkelse og bestemmelse av hemoglobin- og trombocyttnivå (tab 1).
|
Tabell 1 Stadieinndeling av kronisk lymfatisk leukemi etter Binet (9)
|
|
Stadium
|
Involverte lymfoide organer¹
|
Hemoglobin (g/100 ml)
|
Trombocytter (· 10⁹/l)
|
|
A
|
< 3
|
≥ 10
|
≥ 100
|
|
B
|
> 3
|
≥ 10
|
≥ 100
|
|
C
|
Uten betydning
|
< 10²
|
< 100²
|
|
[i]
|
Væskestrømscytometri
Immunfenotyping ble gjort ved hjelp av væskestrømscytometri. Firefargeanalyse av lymfocytter i blod ble utført etter merking med antistoffer, lysering av erytrocytter og cellevask, som tidligere beskrevet (10). Prosentandelen CD38-positive KLL-celler ble estimert ut fra fluorescens i den aktuelle prøven minus fluorescens i kontrollprøven. CD38-positivitet ble definert som ≥ 20 % positive KLL-celler.
Molekylærgenetikk
Genet som kodet for den variable delen av immunglobulinets tunge kjede (VH-genet) i KLL-cellene ble identifisert ved sekvensering, og genets mutasjonsstatus ble undersøkt med DNA-basert teknikk (11, 12). VH-genet ble karakterisert som umutert ved ≥ 98 % homologi med kimbanen og som mutert ved < 98 % homologi med kimbanen (4, 5). Det ble brukt genomisk polymerasekjedereaksjon (PCR) for amplifisering av det rearrangerte VH-genet.
Cytogenetikk
Forekomst av cytogenetiske avvik ble undersøkt ved karyotypering av korttidsdyrkede beinmargsceller (G-banding av kromosomer i metafase) og/eller ved interfase fluorescerende in situ-hybridiserings (FISH)-undersøkelse av blod-eller beinmargsceller etter standardmetoder. FISH-resultatene ble klassifisert som ingen cytogenetiske aberrasjoner, trisomi 12, del(6q23), del(11q22), del(13q14) eller del(17p13) som eneste avvik eller i kombinasjoner (to eller flere avvik funnet hos samme pasient).
Statistiske metoder
Det er benyttet deskriptiv statistikk med angivelse av median, gjennomsnitt, spredning og ratio. Khikvadrattest ble benyttet for å vise samvariasjon mellom biologiske markører. Aldersjustert insidens ble beregnet ut fra standardbefolkningen i USA i år 2000 fordi vi ikke hadde data fra noen norsk befolkning.
Resultater
Pasientene
I studieperioden ble det meldt 388 nye tilfeller av kronisk lymfatisk leukemi til Kreftregisteret. Dette gir en insidens på 3,6/100 000/år (4,8 millioner innbyggere i Norge 2009 – 10). Det tilsvarer en aldersjustert insidens på 3,8/100 000/år. 236 av disse pasientene (61 %) ble inkludert i studien, hvorav åtte ble rubrisert under småcellet lymfocyttært lymfom. Av de inkluderte var det 139 menn og 97 kvinner, det vil si en mann-kvinne-ratio på 1,43.
Stadieinndelingen fremgår av tabell 2. Gjennomsnittsalder ved diagnosetidspunktet var 65,9 år (median 65,0 år). Alderen hos dem som ikke ble inkludert i studien, var gjennomgående høyere – gjennomsnittsalder 72,1 år (median 73,0 år) – og det var en mann-kvinne-ratio på 1,66. I tråd med at majoriteten av pasientene var i stadium A var gjennomsnittsverdiene for hemoglobin 13,5 g/100 ml (median 13,9 g/100 ml; spredning 5,1 – 17,5 g/100 ml), lymfocytter 31 · 10⁹/l (median 16,5 · 10⁹/l, spredning 1,4 – 232 · 10⁹/l) og trombocytter 210 · 10⁹/l (median 211 · 10⁹/l, spredning 29 – 432 · 10⁹/l).
|
Tabell 2 Samvariasjon mellom klinisk stadium, VH-gen, immunfenotype og cytogenetiske avvik ved kronisk lymfatisk leukemi
|
|
Pasienter
|
V
H-gen mutert
|
V
H-gen umutert
|
Ikke data
|
|
Antall (%)
|
Antall (%)
|
Antall (%)
|
Antall (%)
|
|
Stadieinndeling
|
222
|
|
|
|
|
Binet A
|
178 (80)
|
120 (67)
|
28 (16)
|
30 (17)
|
|
Binet B
|
26 (12)
|
7 (27)
|
16 (62)
|
3 (11)
|
|
Binet C
|
18 (8)
|
5 (28)
|
12 (67)
|
1 (6)
|
|
Immunfenotype
|
211
|
|
|
|
|
CD38-positiv
|
59 (28)
|
18 (31)
|
34 (58)
|
7 (12)
|
|
CD38-negativ
|
152 (72)
|
109 (72)
|
19 (13)
|
23 (15)
|
|
FISH-analyse¹
|
112
|
|
|
|
|
Ingen aberrasjoner
|
36 (32)
|
22 (61)
|
7 (19)
|
7 (19)
|
|
del(13q14)
|
53 (47)
|
35 (66)
|
13 (25)
|
2 (4)
|
|
Trisomi 12
|
15 (13)
|
5 (33)
|
8 (53)
|
2 (14)
|
|
del(11q22)
|
11 (10)
|
4 (36)
|
7 (64)
|
0
|
|
del(17p13)
|
8 (7)
|
3 (38)
|
3 (38)
|
2 (25)
|
|
Karyotypering
|
4
|
|
|
|
|
t(14;18)(q32;q21)
|
3
|
2 (67)
|
1 (33)
|
|
|
t(11;14)(q13;q23)
|
1
|
|
1
|
|
|
del(14q22)
|
1
|
|
|
1
|
|
[i]
|
Immunfenotyping
Hos 228 pasienter (97 %) var den væskestrømscytometriske undersøkelsen fullstendig nok til at KLL-skår etter Matutes og medarbeidere kunne angis (den går fra 0 til 5) (13). Maksimal skår er 5 (skår 5 = alternativ diagnose usannsynlig, skår 0 = alternativ diagnose sannsynlig). Det var 192 pasienter med skår 5, 25 med skår 4, ni med skår 3 og to med skår 2. CD38-ekspresjon kunne vurderes hos 211 pasienter – 59 (28 %) hadde CD38-positiv kronisk lymfatisk leukemi og 152 (72 %) CD38-negativ.
Molekylærgenetikk
Identifikasjon av hvilket gen som kodet for den variable delen av immunglobulinets tunge kjede hos KLL-cellene (foretrukket VH-gen) og bestemmelse av VH-genets mutasjonsstatus var mulig hos 199 pasienter (84 %). 138 pasienter (69 %) hadde mutert VH-gen og 61 (31 %) umutert VH-gen. Hos 18 pasienter (9 %) ble det identifisert to VH-gener, det vil si de hadde såkalt biallelisk kronisk lymfatisk leukemi – hos 11 var ett (tre pasienter) eller begge (åtte pasienter) VH-genene umutert og hos sju var begge VH-gener mutert.
Ved kronisk lymfatisk leukemi forekommer noen VH-gener hyppigere enn andre, og vi fant særlig hyppig (> 10 pasienter) bruk av følgende gener: VH1 – 69, VH3 – 7, VH3 – 23, VH3 – 30 og VH4 – 34.
Der VH3 – 21 er det foretrukne VH-genet, er prognosen dårlig – uavhengig av dette VH-genets mutasjonsstatus (14). Vi fant at VH3 – 21 var det foretrukne IgVH-genet hos åtte pasienter (4 %) – det var mutert hos to og umutert hos seks.
Cytogenetikk
Cytogenetisk undersøkelse med FISH var vellykket hos 112 pasienter. Hos én pasient ble karyotypen fastslått ved G-banding alene. Hos 36 pasienter (32 %) ble det ikke påvist cytogenetiske aberrasjoner, mens dette ble påvist hos 77 (68 %) (tab 2). Karyotypering med G-banding ble utført hos 25 pasienter og avdekket t(14;18)(q32;q21) hos tre, t(11;14)(q13;q32) hos én og del(14q22) hos én.
Pasienten med t(11;14)(q13;q32) hadde både kronisk lymfatisk leukemi og mantelcellelymfom, med omtrent like store cellepopulasjoner vurdert ved væskestrømscytometrisk undersøkelse av beinmargen. Det er overveiende sannsynlig at translokasjonen var knyttet til mantelcellelymfomet fordi denne translokasjonen er karakteristisk for dette lymfomet.
Hos 13 pasienter (12 %) var karyotypen karakterisert ved mer enn én aberrasjon . Tre pasienter fikk påvist t(14;18)(q32;q21), som er karakteristisk for follikulært lymfom. Ingen av disse tre hadde lymfeknutesvulst av betydning, og tumorcellene hadde hos alle tre karakteristisk KLL-immunfenotype (KLL-skår 5) og andre cytogenetiske aberrasjoner som ses hyppig ved kronisk lymfatisk leukemi og ikke ved follikulært lymfom.
Samvariasjon mellom de ulike biologiske markørene
Materialet viste entydig at de ulike biologiske markørene samvarierer, men det er ikke slik at én markør kan benyttes som surrogatmarkør for én eller flere av de andre. Hos pasienter i Binets stadium A var det foretrukne VH-gen mutert hos flertallet, mens det motsatte var tilfellet hos pasienter i Binets stadium B og stadium C (p < 0,001). CD38-positiv kronisk lymfatisk leukemi var assosiert med umutert og CD38-negativ sykdom med mutert VH-gen (p < 0,001).
Ved cytogenetiske forandringer som er assosiert med god prognose, var det foretrukne VH-gen oftest mutert. Det motsatte var tilfellet ved del(11q22), som er forbundet med dårlig prognose. Dette er oppsummert i tabell 2. Tabell 3 viser at det ikke var tilfeldig om VH-genet er mutert eller ikke ved ulik VH-gen bruk. VH1 – 69 forekom hovedsakelig umutert, det motsatte var tilfellet for VH4 – 34, VH3 – 7 og VH3 – 23.
|
Tabell 3 Mutasjonsstatus hos VH-gener som forekommer hyppig hos pasienter med kronisk lymfatisk leukemi
|
|
Foretrukket V
H-gen
|
Antall pasienter
|
Mutert (%)
|
Umutert (%)
|
|
VH1 – 69
|
18
|
28
|
72
|
|
VH3 – 7
|
20
|
90
|
10
|
|
VH3 – 23
|
16
|
94
|
6
|
|
VH3 – 30
|
20
|
65
|
35
|
|
VH4 – 34
|
25
|
80
|
20
|
Diskusjon
I studieperioden registrerte Kreftregisteret 388 nye tilfeller av kronisk lymfatisk leukemi, noe som tilsvarer en aldersjustert insidens på 3,8/100 000/år. Dette samsvarer godt med en nyere amerikansk undersøkelse, der man angir en aldersjustert insidens på 3,83/100 000/år, med en klar mannsdominans (15), men er noe lavere enn i tidligere publiserte nordiske materialer, som kunne tyde på en insidens på 4/100 000/år (16, 17).
Hovedmålsettingen med studien var å kartlegge utbredelsen av biologiske markører med prognostisk utsagnskraft i et uselektert materiale, og legene ble oppfordret til å gjennomføre de aktuelle undersøkelsene hos alle nydiagnostiserte. Dette ble gjort, om enn ikke fullstendig, hos de inkluderte. Disse var vesentlig yngre enn de som ikke ble inkludert (median 65 år versus 73 år). De aktuelle undersøkelsene er ganske ressurs- og kostnadskrevende. Det er derfor nærliggende å tro at legene har unnlatt å foreta disse undersøkelsene hos de eldste fordi resultatet ikke ville ha konsekvenser for valg av behandling.
Mangelfull inklusjon av overveiende eldre pasienter har liten betydning for våre beregninger av den relative fordelingen av prognostiske faktorer i pasientpopulasjonen fordi disse faktorene ikke viser ulik fordeling i ulike aldersgrupper. Derimot er det en klar kjønnsforskjell – høyrisikofaktorer ses hyppigere hos menn enn hos kvinner (4 – 6). Vår studie må likevel kunne sies å være populasjonsbasert og representativ, men den er ikke uselektert. Seleksjonen synes i stor grad å ligge hos legene fordi noen geografiske områder ikke er representert i studien i tråd med en tidligere studie (1). Beregningene av insidens og kjønnsfordeling var basert på lovpålagte meldinger til Kreftregisteret og ble derfor gjort i et uselektert materiale.
I de første studiene som beskrev det foretrukne VH-genets mutasjonsstatus ved kronisk lymfatisk leukemi, var det tilnærmet lik fordeling av pasienter med mutert og pasienter med umutert VH-gen (4, 5). Vi fant, derimot, at 69 % av pasientene hadde mutert VH-gen og 31 % umutert. Dette samsvarer med nylig publiserte populasjonsbaserte studier fra Europa og USA (18, 19), noe som skulle tilsi at vår studie er representativ. De første rapportene kom fra spesialiserte sykehusavdelinger, mens vår studie og de nyere internasjonale studiene er populasjonsbaserte og dermed favner en pasientpopulasjon som i større grad inkluderer dem med indolent sykdom, hvor vi ville forvente at kronisk lymfatisk leukemi med mutert VH-gen dominerer.
Allerede i 1988 beskrev Kipps og medarbeidere at KLL-celler benyttet et begrenset repertoar av VH-gener (20). Disse observasjonene er bekreftet i flere studier, og en metaanalyse viser at de foretrukne VH-genfamiliene ved kronisk lymfatisk leukemi skiller seg fra repertoaret hos normale B-lymfocytter (21, 22). Vår studie føyer seg inn i rekken.
Kronisk lymfatisk leukemi hvor begge IgH-gener er rearrangert er velkjent. Det benevnes biallelisk kronisk lymfatisk leukemi, til forskjell fra biklonal kronisk lymfatisk leukemi, hvor to ulike KLL-kloner forekommer side om side (23, 24). Hvor hyppig biallelisk kronisk lymfatisk leukemi er, har ikke vært omtalt tidligere. I vårt materiale hadde 9 % av pasientene biallelisk kronisk lymfatisk leukemi, og ett eller begge de foretrukne VH-genene var umutert hos flertallet (61 %).
Vi fant, i likhet med andre, at KLL-cellene hos en drøy firedel av pasientene uttrykte CD38 på celleoverflaten (19). CD38-positiv kronisk lymfatisk leukemi benyttet som oftest et umutert VH-gen (58 %), men CD38-ekspresjonen kan på ingen måte benyttes som surrogatmarkør for VH-genets mutasjonsstatus (7).
I sykehusmaterialer er det rapportert at ca. 80 % av pasientene har genetiske aberrasjoner i KLL-cellene når de blir undersøkt for del(13q14), del(11q22), del(17p13) eller trisomi 12 ved hjelp av FISH-analyse, mens ca. 20 % ikke har cytogenetiske avvik (6). I vårt materiale er andelen uten cytogenetiske aberrasjoner noe høyere (33 %), men den innbyrdes fordelingen av de ulike cytogenetiske aberrasjonene er slik som rapportert av andre (tab 2). Hos 12 % av pasientene fant vi flere cytogenetiske aberrasjoner. Andre har vist at prognosen hos disse pasientene bestemmes av den aberrasjonen som er assosiert med dårligst prognose (6).
Det kan være flere forklaringer på den noe høyere andelen uten cytogenetiske aberrasjoner i vårt materiale. Metodologisk forhold som resulterte i at avvik ikke ble oppdaget, er én mulighet, men hvis dette skulle være forklaringen, ville vi forventet avvik også i den innbyrdes fordelingen av cytogenetiske aberrasjoner i forhold til andre materialer. De aktuelle cytogenetiske avvikene regnes ikke som primære patogenetiske hendelser ved kronisk lymfatisk leukemi, de kommer til underveis. Det er derfor nærliggende å forvente en høyere andel pasienter uten cytogenetiske aberrasjoner i et populasjonsbasert materiale enn i materialer fra spesialavdelinger. En begrensning ved vårt materiale er at cytogenetisk undersøkelse ble utført hos en relativt lav andel av pasientene (48 %).
De biologiske markørene har stor prognostisk utsagnskraft, og de kan være til stor hjelp ved informasjon til den enkelte pasient om prognosen. Dette er spesielt viktig fordi hoveddelen av pasientene blir diagnostisert i en asymptomatisk fase av sykdommen da behandling ikke er indisert. Foreløpig er det ikke aktuelt å velge behandling på basis av biologiske markører – med ett unntak: Ved kronisk lymfatisk leukemi karakterisert ved del(17p13) er det enighet om at pasientene bør få behandling som er uavhengig av p53-signalveien (genet TP53 ligger i kromosombånd 17p13) for å være effektiv (25). Immunkjemoterapi (rituximab, fludarabin og cyklofosfamid) anses i dag som den beste førstelinjebehandlingen ved kronisk lymfatisk leukemi for dem som tåler aggressiv terapi (70 år eller yngre og ingen komorbiditet). Effekten av immunkjemoterapi er spesielt god ved umutert VH-gen, del(13q14) og del(11q23) (26).
